论文部分内容阅读
目的:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性系统性炎症疾病,随着免疫抑制剂的广泛应用,致残率已显著下降,但心血管疾病作为其远期并发症已经成为RA患者的首要死亡原因,其中早发动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)占有较高的比率。目前认为动脉粥样硬化是一种炎症性疾病,多种细胞因子与单核/巨噬细胞、血管内皮细胞之间形成的炎症反应网络,贯穿于动脉粥样硬化发生、发展的全过程。因此研究细胞因子在RA患者动脉粥样硬化的发生和发展中的作用具有重要的临床价值。高迁移率族蛋白(high mobility group box protein HMGB)-1是RA发病过程中重要的炎症因子。HMGB-1还可激活单核/巨噬细胞系统加速动脉粥样硬化的发生,说明HMGB-1与动脉粥样硬化相关,但其机制尚不十分明确。Toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)是一类细胞表面信号传导跨膜受体,HMGB-1的受体之一,它可通过多种途径影响动脉粥样硬化的形成。那么,HMGB-1是否通过与受体TLR4的结合影响了内皮细胞功能而促进动脉粥样硬化的发生发展呢?临床研究显示,早期应用慢作用药物可以降低RA患者心血管疾病的发病率。来氟米特( leflunomide, LEF)属慢作用药物的一种,具有抗炎及免疫抑制作用。它可以通过改善脂质代谢而降低动脉粥样硬化的发生。但尚未见LEF对内皮细胞功能影响的研究报导。本实验即采用体外细胞培养的方法,观察HMGB-1对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC )功能的影响及来氟米特对内皮细胞是否具有保护作用,并探讨其可能机制,为RA患者早发动脉粥样硬化的防治提供一定的理论依据。方法:人脐静脉内皮细胞应用DMEM培养基进行体外培养,其中含10%胎牛血清及100KU/L青霉素、100mg/L链霉素。MTT检测不同浓度LEF对脐静脉内皮细胞生长的影响,按MTT结果将细胞分为正常对照组,HMGB-1刺激组(10ng/ml),HMGB-1分别加10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml LEF干预组。免疫细胞化学和Western blotting检测脐静脉内皮细胞的细胞间粘附分子(intercellular adhesion molecule,ICAM)-1蛋白的表达;RT-PCR检测细胞ICAM-1和TLR4 mRNA的表达。结果:1不同浓度LEF对HMGB-1诱导的脐静脉内皮细胞生长的影响MTT结果显示,LEF呈浓度依赖性抑制HMGB-1诱导的内皮细胞增殖,2.5μg/ml及5μg/ml LEF对内皮细胞生长抑制率很低,160μg/ml的LEF 24h的抑制率可达82%。2 HUVEC细胞ICAM-1蛋白的表达情况免疫细胞化学结果显示,ICAM-1蛋白阳性颗粒主要表达于细胞浆中,呈棕黄色颗粒。正常对照组可见少量表达,HMGB-1刺激后细胞的ICAM-1蛋白表达显著增加。而LEF干预组的ICAM-1阳性表达强度较HMGB-1组降低,随着LEF浓度的增加,ICAM-1蛋白的表达逐渐减弱。Western blotting结果显示,HMGB-1刺激24h后HUVEC细胞ICAM-1表达明显升高,与正常对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。LEF干预组ICAM-1蛋白表达与HMGB-1组相比表达下降,并随LEF浓度的增加而逐渐降低。3 HUVEC细胞ICAM-1 mRNA的表达情况RT-PCR结果显示,HMGB-1刺激细胞后可以明显上调ICAM-1 mRNA的表达,与对照组相比差异具有显著统计学意义(P<0.01)。LEF组ICAM-1表达明显下降,以40μg/ml LEF组为著,与HMGB-1组相比差异有显著统计学意义(p<0.01)。4 HUVEC细胞TLR4 mRNA的表达情况RT-PCR结果表明,正常细胞中TLR4 mRNA的表达量很少,HMGB-1可明显上调内皮细胞TLR4 mRNA的表达。应用LEF干预24h后TLR4的表达呈浓度依赖性下降,以40μg/ml LEF组为著,与HMGB-1组比较差异有显著意义(P<0.01)。5相关性分析经pearson相关分析, ICAM-1mRNA与TLR4 mRNA的表达水平之间呈显著正相关(r=0.977,P=0.004)。结论:1 HMGB-1通过上调ICAM-1的表达损伤内皮细胞功能,而LEF可抑制ICAM-1的表达对内皮细胞功能起保护作用。2 HMGB-1上调ICAM-1的表达及LEF的抑制作用部分可能是通过受体TLR4实现的。