论文部分内容阅读
目的人巨细胞病毒(HCMV)是最大的人类疱疹病毒,通常在生命早期获得并在初次感染后即可建立终身潜伏感染。一旦建立潜伏感染,病毒可在宿主体内终身不被清除,并可在免疫缺陷的个体中引起严重疾病。IE2是HCMV编码的重要蛋白,在病毒的复制和致病进程中起着相当重要的作用。T淋巴细胞是最重要的免疫细胞,它可以通过其细胞表面的特异性T细胞受体(TCR)识别抗原肽激活人类的获得性免疫应答。T细胞抗原识别受体的多样性决定了宿主的免疫反应和疾病的预后。目前,HCMV已经开发出了多种免疫逃逸的策略使其能够在宿主体内长期潜伏感染。本次实验的目的就是探究在HCMV潜伏感染期间,宿主免疫系统T细胞识别受体文库及其多样性是否发生了改变。由于HCMV具有严格的物种特异性,我们建立了能够稳定且持续表达IE2的UL122基因修饰小鼠模型。该动物模型的建立,打破了HCMV的种属特异性,因此我们可通过体内实验研究IE2蛋白对小鼠免疫系统TCR文库的影响。方法1.通过构建含有IE2基因cDNA片段的pAV.Ex1d-CMV-IE2-IRES/eGFP载体,显微注射C57/BL6小鼠受精卵和胚胎移植得到F0代IE2小鼠。通过PCR技术鉴定转基因小鼠中IE2的表达。繁殖转基因鼠后得到子代F1,通过PCR鉴定将转基因小鼠分为阳性组和阴性组。2.使用免疫组织化学技术检测两组小鼠免疫器官(脾脏和淋巴结)中IE2的表达,并用流式细胞术检测了转基因小鼠的CD4~+T细胞和CD8~+T细胞的数量。3.高通量测序技术检测并分析IE2阳性和阴性组小鼠的外周血T淋巴细胞表面识别受体TCR的Vβ和Jβ基因区段的差异以及TCR多样性的变化。结果1.成功构建了pAV.ExBi-CMV-IE2-IRES-eGFP表达载体,经显微注射等技术获得四只阳性转基因首建鼠。通过与野生型C57/BL6小鼠杂交后得到新的子代F1代转基因小鼠。通过提取鼠尾DNA及PCR鉴定得到IE2阳性和阴性的小鼠作为实验组和对照组进行后续实验。2.免疫组织化学结果显示,IE2蛋白在IE2阳性的转基因小鼠的脾脏和淋巴结中呈现核染色强阳性,证明在其免疫器官中有明显广泛的表达。而在IE2阴性的对照组转基因小鼠的脾脏和淋巴结中均未有IE2蛋白的表达。3.流式细胞术结果显示,转基因小鼠外周血CD4~+T细胞的CD8~+T细胞的比例发生了改变。其中,IE2阳性的转基因小鼠CD4~+T细胞相较于阴性组而言保持低水平,而CD8~+T淋巴细胞相较于阴性组而言保持较高水平。4.高通量测序技术检测TCR文库的结果显示,在阳性组小鼠中,TCRβ链的分布比例明显低于阴性组小鼠。两组间Vβ,Jβ基因和V-J组合的分布没有明显差异,但是阳性组中独特CDR3aa克隆型的比例较低。同时,基尼指数,辛普森多样性指数,标准化香农多样性指数和Rank-abundance均表明:与阴性组相比,阳性转基因小鼠的TCR多样性较低。结论1.成功构建了稳定且持续表达IE2蛋白的转基因小鼠模型。2.IE2蛋白的表达影响宿主免疫器官和外周血T淋巴细胞的发育和分布。3.IE2的表达引起了宿主TCR文库的改变,并且使宿主的TCR多样性降低。4.转基因模型小鼠TCR文库多样性的降低,揭示了IE2的表达可能导致细胞免疫的改变,并且可能与机体抗肿瘤免疫与病毒逃逸有关。