浑浊红球菌海藻糖合成酶基因的克隆、表达与功能鉴定

来源 :中国农业科学院 | 被引量 : 2次 | 上传用户:tianjinajun
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海藻糖是一种非还原性二糖,它是由两分子葡萄糖通过α, α-(1,1)糖苷键连接而成。海藻糖和它的衍生物能够作为一种保护剂来抵抗多种环境压力,如寒冷、热激、脱水等。因此海藻糖可以被用来作为一种有用的添加剂应用在工业领域,如食品、化妆品和制药工程等。五种不同的合成途径可以生成海藻糖:(a) TPS-TPP;(b) TreP;(c) TreT;(d) TreY-TreZ和(e) TreS。其中海藻糖合成酶(TreS)可以通过转糖苷键作用一步生成海藻糖。这个途径很适合用于工业化生产海藻糖。红球菌属的有很强的代谢多种有害物质的能力,并能存活于极端环境中。浑浊红球菌B4菌株作为一种有机溶剂耐受菌能在少于1%(w/v)的无水环境中存活。浑浊红球菌的这种疏水性主要归功于它的细胞膜,在其膜上包含了许多脂类,尤其是海藻糖霉菌酸酯。浑浊红球菌的基因组序列于3年前公布。然而,据我们所知,还没有对其公布的海藻糖进行生化或理化的分析。本文是首次报道来自红球菌属海藻糖合成酶,这将为海藻糖合成酶和红球菌的研究提供有用的信息。本实验的工作主要从以下几个方面展开:1、通过PCR的方式从浑浊红球菌的基因组中扩增海藻糖合成酶基因,结果得到一个长度为1857bp的序列。已将其注册在GenBank中,登录号为:KC473564;2、利用限制性酶切位点BglII和HindIII构建表达载体pRSET-B-treS,并将其用T7启动子在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行过表达。重组蛋白的分子量为79kDa。可溶性海藻糖合成酶的表达量为321μg/mL;3、对重组海藻糖合成酶的生物学功能及主要酶学特性进行分析。TLC和HPLC结果说明重组蛋白有通过一步法催化麦芽糖与海藻糖相互转化的能力。重组酶的最适温度为25℃,最适pH为7.0,诱导前菌液OD600为0.6左右,诱导的最佳时间为6h。动力学分析(kcat/Km)结果显示海藻糖催化麦芽糖的能力是催化海藻糖能力的4倍。金属离子Hg2+,Cu2+和Al3+抑制酶的活性,Ca2+和Mn2+可促进酶活。EDTA的存在对酶活影响不大。在浑浊红球菌海藻糖合成酶中有五个保守氨基酸,分别是Asp244,Glu286, Asp354, His147和His353,这几个氨基酸在α-淀粉酶家族中也是保守的。海藻糖合成酶除了具有将麦芽糖生成为海藻糖的转移酶活性外,还具有将麦芽糖水解为葡萄糖的水解酶活性。葡萄糖作为一种副产物常出现在麦芽糖生成海藻糖的过程中,且葡萄糖的存在降低海藻糖合成酶的转移酶活性,从而降低海藻糖的生成率。
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