论文部分内容阅读
蚕桑产业是我国传统优势产业,我国生丝产量占世界的80%左右,在国际上占绝对优势地位,蚕桑产业当前在我国农村脱贫致富和乡村振兴中发挥着重要作用。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）感染引发的家蚕血液型脓病常对蚕桑产业造成严重危害,产生巨大的经济损失。家蚕对BmNPV的抗性主要受遗传因素控制,遗传学研究和抗性分析表明,家蚕对BmNPV侵染的抗性由主效基因和微效基因协同控制。蚕业科研人员一直致力于筛选抗性家蚕品种资源和发现抗性基因,阐明家蚕对BmNPV抗性的分子机制。我们团队此前已经将华康系列抗性品种由来的AN品系的抗性基因定位于家蚕第27连锁群,但家蚕主效基因的本质尚未明确,其对BmNPV感染的分子机制尚不清楚。本课题组通过转录组测序以及基因组定位研究发现,家蚕促海藻糖转运蛋白1异构体X1（Bombyx mori facilitated trehalose transporter Tret1-like isoform X1,BmTret1-X1）基因在不同BmNPV抗性水平的家蚕品系中表现出显著表达差异,推测BmTret1-X1可能参与家蚕抗BmNPV感染过程,但缺乏进一步的研究证据。本研究通过在家蚕BmN细胞中过表达BmTret1-X1和通过si RNA转染降低BmN细胞中BmTret1-X1的表达,对BmTret1-X1基因在家蚕对BmNPV抵抗性中的作用进行了研究,获得以下研究成果。1.家蚕不同BmNPV抗性品系中肠组织转录组结果分析验证首先,结合前期基因精细定位结果对转录组测序进行分析发现,BmNPV抗性近等基因系C108＿AN中肠组织与感性品种C108的样品之间海藻糖转运蛋白基因BmTret1-X1在攻毒后12 h,24 h,36 h,48 h,60 h均有极显著的上调表达,log2（fc）分别为4.246、3.309、5.36、3.712和4.643。用RT-q PCR对BmNPV经口攻毒组和常规饲养对照组的AN、C108、C108＿AN家蚕的中肠组织进行了BmTret1-X1表达分析,发现在5龄起蚕至48 h之间,抗性品系AN和近等基因系C108＿AN的BmTret1-X1基因表达量相近,二者都远高于感性品种C108的表达量,且差异极显著（P＜0.01）;BmTret1-X1基因表达量与蚕品种的遗传基础有关,没有BmNPV感染诱导现象。综合分析上述结果认为,蚕品种之间BmTret1-X1表达水平的差异可能与家蚕对BmNPV的抗性差异具有一定的关联。2.家蚕BmTret1-X1克隆与分子特征分析对BmTret1-X1序列进行生物信息学分析结果显示,BmTret1-X1核苷酸序列包含一个654 bp的5’端UTR、一个147 bp的3’端UTR和一个长1476 bp的开放阅读框（ORF）,编码491位氨基酸,包含一个信号肽和12个跨膜域,并形成了2个比较大的膜外功能区。蛋白同源比对分析结果显示BmTret1-X1与其他鳞翅目昆虫的Tret1同源性较低。抗性品种AN与感性品种C108之间在BmTret1-X1基因第71、90、168、480位有4个SNP导致的氨基酸编码差异,AN品系分别为I、V、Y和E,C108品系变为V、I、C和V;利用SWISS-MODEL进行蛋白三级结构预测,发现AN和C108品系的BmTRET1-X1蛋白的结构有所变化。3.BmTret1-X1基因表达对BmNPV病毒增殖的抑制效果鉴定在BmN细胞转染BmTret1-X1基因表达载体p IZT/V5-His-m Cherry-BmTret1-X1（红色荧光）,然后添加BmNPV重组病毒BV-EGFP（绿色荧光）,利用荧光显微镜观察并对荧光强度进行定量,来检测过表达BmTret1-X1基因对BmNPV病毒复制增殖的影响,BmNPV感染后24 h、48 h、72 h对照组与BmTret1-X1过表达组的绿色平均荧光强度比值分别为2.02、3.21和1.52,表明BmTret1-X1过表达组的病毒增殖在感染24 h、48 h被抑制,72 h的抑制效果减弱。4.BmTret1-X1基因过表达对BmNPV基因表达与基因组复制的影响过表达组BmN细胞的BmTret1-X1表达量提高70-250倍左右（P＜0.01）,BmNPV侵染24 h、48 h和72 h病毒基因lef-3、p10及gp64的表达量降低5-45倍（P＜0.01）,尤其是编码核衣壳蛋白的vp39基因降低高达1089倍（P＜0.01）。表明BmTret1-X1基因的表达对BmNPV的病毒基因的表达具有明确的抑制作用。在病毒侵染后24 h、48 h和72 h后,BmTret1-X1过表达组的病毒基因组含量低于对照组,病毒侵染24 h时抑制效果最显著（P＜0.01）,表明过表达BmTret1-X1对BmNPV病毒的基因组复制产生了抑制作用。5.BmTret1-X1抗BmNPV病毒能力与SNP位点相关性SNP/INDEL分析和基因克隆测序结果显示,在家蚕抗性品系AN和感性品系C108之间存在4个SNP位点导致的氨基酸序列改变,使得所预测的蛋白三级结构存在一定差异。为了探究该基因多态性是否与AN品系抗BmNPV病毒能力相关,我们通过在BmN细胞中过表达AN-BmTret1-X1和C108-BmTret1-X1基因后侵染BV-EFGP利用荧光显微镜观察进行荧光强度定量,分析两者对BmNPV抑制效果是否有差异。发现两种质粒转染效率相近时,对BmNPV增殖的抑制效果基本相同。使用荧光定量PCR技术检测BmNPV病毒基因转录水平及基因组复制的变化,发现在AN-BmTret1-X1和C108-BmTret1-X1过表达倍数相近时,对BmNPV病毒基因转录水平和基因组复制的抑制作用无明显差别。表明AN和C108品种之间4个氨基酸位点的变化对BmNPV抗性无直接影响。6.BmN细胞RNA干扰BmTret1-X1对BmNPV基因表达和病毒增殖的影响RNA干扰组BmTret1-X1的转录水平降低约50%左右,BmNPV的lef-3、vp39、p10及gp64在病毒侵染6 h、12 h、24 h、和48 h后有一定水平的表达上升,表明宿主细胞BmTret1-X1基因的沉默可以较显著促进BmNPV病毒基因的表达。荧光观察显示对BmN细胞BmTret1-X1基因的RNA干扰能较显著促进病毒的增殖。