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目的：为研究关节软骨与骺板损伤的基因治疗创造条件，构建人转化生长因子β3（TGF-β3）的真核表达载体，并转染大鼠前软骨干细胞（PSCs），以获得组织工程的种子细胞。探讨稳定表达重组TGF-β3对前软骨干细胞（PSCs）增殖及向成软骨方向定向分化的诱导作用。通过将软骨诱导活性的TGF-β3基因非共价结合于自组装多肽凝胶组织工程支架基质材料上，制备具有软骨诱导活性的新型基因活性基质材料（GAM），以促进种子细胞定向分化。对比基因强化组织工程的不同方法研究载基因介质与转基因介质对成软骨诱导分化的体外研究，来评价其成软骨诱导作用。方法：（1）基因工程的方法重组构建pcDNA3.1（+）-hTGF-β3真核表达载体并鉴定：通过聚合酶链式反应（PCR）扩增编码hTGF-β3的编码序列（cds），在其启动子上游加XhoⅠ酶切位点，终止子下游加BamHⅠ酶切位点，双酶切载体pcDNA3.1（+）和hTGF-β3片段，回收后T4DNA连接酶连接，连接产物转化感受态DH5α，涂板孵育挑取阳性克隆，提取质粒，酶切、测序鉴定。（2）免疫磁珠法分离纯化大鼠前软骨干细胞：在手术显微镜下（×10倍）钝性分离大鼠La Croix环，采用三步酶消化法获得含有PSCs的混合细胞。48小时后，按操作说明采用免疫磁珠分选系统纯化上述细胞，即可得到FGFR-3阳性细胞。将细胞种入培养瓶中培养。（3）纳米级的高分子聚合物线性化的聚乙烯亚胺（PEI）共转染转染：pcDNA3.1（+）-hTGF-β3与pcDNA3.1-EGFP，PEI和DNA混合的量的N／P比5左右，48小时候终止转染。（4）观察和检测瞬时转染后的表达情况：转染后48小时，收获细胞。提取总RNA，逆转录，PCR检测TGF-β3表达情况。收集转染后24hr，48hr，72hr，96hr，120hr时点转染组细胞和未转染组细胞培养上清液，采用双抗体夹心ELISA法，以TGF-β3纯品制作标准曲线，测定转染组与未转染组各代细胞培养上清液中TGF-β3蛋白的浓度。（5）抗生素筛选稳定表达TGF-β3克隆：48h后终止转染，更换含有G418的培养基进行稳定筛选。至细胞阳性克隆形成后，挑取单克隆并扩大培养。（6）噻唑蓝（MTT）检测增殖情况：将转染组和未转染组细胞按每孔5.0×103的密度接种至96孔板中，分别于0，24，48，72，96h加入浓度为5mg／ml MTT 20μl，置培养箱避光孵育4h，然后弃上清，加入150μl的DMSO。振荡充分溶解后，在酶标仪570nm波长度吸光度值，并绘制生长曲线。（7）流式细胞术测定转染对PSCs增殖和DNA合成的影响：收集第2代细胞，分为未转染组与转染组，预处理后，上机检测，测定细胞周期，观察G1期、S期、G2期细胞各占的百分比。（8） qRT-PCR检测成软骨基因表达情况：：收获转染组和未转染组细胞细胞，提取总RNA，逆转录。使用GAPDH作为内参照，实用Sybr Green法进行相对实时定量。相对转录水平通过比较Ct来确定。Y=2-ΔΔCt，ΔΔCt=ΔE-ΔC，ΔE=Ct转染组-CtGAPDH，ΔC=Ct未转染组-CtGAPDH。（9）免疫组化及western blot的方法比较转染后目的基因和软骨特异性标志物表达的情况：取稳定表达TGFβ3的PSCs和未转染组细胞做爬片，用4℃固定液（丙酮：乙醇1：1）固定20min，免疫组化，HE，番红O等检测。取转染组和未转染组细胞，提取细胞总蛋白质，用BCA法测定样品蛋白浓度，取20ug总蛋白行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），然后转移至硝酸纤维素膜，剪取相应条带，加入用脱脂奶粉配成的1：200兔抗大鼠Ⅱ型胶原抗体或1：100的兔抗大鼠β-actin多克隆抗体的抗体稀释液，4℃封闭孵育过夜，PBS洗后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（1：2000），37℃振荡孵育1h，漂洗后采用化学发光发检测，于暗室中曝光后洗片，扫描，灰度分析。（10）用固相法合成KLD-12多肽并通过高压液相色谱及质谱仪纯化并鉴定；取0.5％（w／v）多肽在生理溶液条件自组装成多肽凝胶装物质，将TGF-β3质粒与KLD-12多肽间非共价键结合负载质粒并检测其DNA释放能力。（11）实验分四组，A组取转染TGF-β3细胞与KLD-12混合，B组取PSCs细胞与载基因支架混合，C组取PSCs与KLD-12混合，D组为KLD-12支架。通过噻唑蓝（MTT）法检测细胞生长情况，qRT-PCR法检测成软骨基因表达情况Alcian Blue法检测软骨外基质sGAG含量。结果：（1）重组质粒经过酶切电泳，和测序证实构建成功，共转染后在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光，RT-PCR和Elisa可以检测到有目的基因的表达。转染后24h，上清液中TGF-β3含量即呈上升趋势，在72h后逐渐下降。（2） hTGF-β3在分离纯化的PSCs中稳定表达。MTT结果显示，2d内转染组和未转染组的增殖活性比较，差异无统计学意义（p＞0.05）；随着时间的延长，转染组的增殖效率明显高于未转染组qRT-PCR结果显示，转染组软骨特异的标志物基因表达都有不同程度的上升（p＜0.05）。免疫组化学结果表明转染后PSCs细胞外基质的染色增多并加深，并且出现软骨细胞表型的表达，Ⅱ型胶原染色也加深。Western blot检测结果显示，转染组对软骨表面标志Ⅱ型胶原（collagen typeⅡ）表达明显增高，TGF-β3的表达也显著增高，灰度值测量显示差异有统计学意义（p＜0.05）。（3） KLD-12多肽序列合成成功，其相对分子质量为1 466.9；负载TGF-β3基因的白组装肽凝胶支架的基因释放DNA含量于3 d内达高峰，2周内可维持在较高水平。（4） A组增殖能力始终要强于其他两组，B组与C组之间的增殖能力差异在10d左右开始具有统计学意义（p＜0.05）。A组，B组随着培养时间延长软骨标志物基因上调明显，与C组之间的差异有统计学意义（p＜0.05），软骨外基质sGAG与DNA含量在A组，B组，C组之间的两两差异具有统计学意义。结论：通过上述实验，正确构建真核表达载体hTGF-β3的重组质粒，并成功转染PSCs，为软骨组织工程的的基因强化研究提供了新的备选基因及种子细胞。通过压力筛选后，获得的hTGF-β3基因强化的PSCs的细胞株，可以稳定表达高效的hTGF-β3蛋白，从而促进PSCs的增殖并向成软骨方向分化，为软骨缺损的高效修复提供了新的手段。成功合成负载TGF-β3基因自组装肽凝胶基质材料，并进行质粒释放动力学检测，该材料可在2周左右保持较高的质粒释放水平，有利与组织的修复。基因强化的基质材料可以作为软骨，骺板组织工程修复的基因及细胞载体，为构建具有正常结构功能的软骨，骺板组织提供了新的思路。但是由于其处于研究初期，还有很多问题有待解决。