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高尿酸血症是与尿酸密切相关的代谢疾病,然而,治疗药物别嘌呤醇和非布司他等会产生一系列毒副作用,如过敏反应、皮疹、发热和肾病。核桃是一种兼具高蛋白营养价值和生物活性的食物来源。本文以脱脂核桃粉为研究对象,通过高尿酸血症动物模型来评价其降尿酸功效,并以黄嘌呤氧化酶(XO)抑制活性作为导向对核桃蛋白肽进行分离纯化、结构鉴定和功能评价。同时采用分子对接技术对20种氨基酸、400种二肽和8000种三肽进行XO抑制活性肽高通量筛选和构效关系分析,并对核桃蛋白肽进行结构改良设计,进一步对多肽的XO抑制活性和抗氧化活性进行相关性和功能分析。此外,以核桃蛋白肽作为研究对象,进行体外模拟消化和吸收功效研究。结果表明:在体内高尿酸血症大鼠降尿酸功效评价中,脱脂核桃蛋白酶解物(WMH)和脱脂脱酚核桃蛋白酶解物(DWMH)都具有一定的降尿酸功效,且具有保护肾组织功能结构免受尿酸过多所造成的损伤作用。其中,DWMH比WMH在体内降尿酸、体外XO抑制、尿素氮和肌酐含量降低等作用中效果要好。对DWMH分离纯化后,采用超高压液相色谱高分辨质谱联用共解析出7种核桃蛋白肽片段,分别为Trp-Asp-Asp(WDD)、His-Cys-Pro-Phe(HCPF)、Trp-Asp-Gln-Trp(WDQW)、Pro-Pro-Lys-Asn-Trp(PPKNW)、Trp-Pro-Pro-Lys-Asn(WPPKN)、Ala-Asp-Ile-Tyr-Thr-Glu(ADIYTE)和Trp-Ser-Arg-Glu-Glu-Gln-Glu(WSREEQE)。分子对接结果得出,芳香族氨基酸,包括Trp、Tyr、Phe和His,具有较高的Vina分数,预测这类氨基酸能促使多肽具有较高的XO抑制活性。尤其是Trp氨基酸,其对XO的作用与传统高尿酸血症和痛风治疗药物别嘌呤醇类似,能与XO重要氨基酸残基Glu802、Leu873、Ser876、Arg880、Phe914、Phe1009,Thr1010、Val1011、Leu1014、Ala1078和Ala1079结合,促使多肽具有相对较高的Vina分数,发挥较强的XO抑制活性。总体上,芳香族的氨基酸残基在N端位置有利于多肽具有较高的Vina分数,然而,芳香族的氨基酸残基在中间位置却不利于多肽Vina分数的提高,从而预测不能有效抑制XO的催化活性。基于多肽的体外XO抑制和抗氧化活性结果,核桃蛋白肽WDD、WDQW、PPKNW、WPPKN和WSREEQE,同时具有较强的XO抑制和抗氧化活性,尤其是多肽WDQW。通过构效分析发现,Trp、Cys氨基酸残基能够分别显著提高XO抑制活性和DPPH自由基清除活性,而高的ORAC活性主要依赖于多肽的Trp和Tyr氨基酸残基。多肽含有Trp氨基酸残基在C端比在N端具有更高的DPPH自由基清除活性。氢原子供体氨基酸残基含量和Trp氨基酸残基个数的增加,能有效增强多肽的XO抑制活性、ORAC和DPPH自由基清除活性,并且这些活性之间存在强的相关性。与多肽WDQW相比,通过结构改良设计的多肽Trp-Asp-Gln-Trp-Trp、Trp-Trp-Trp-Asp-Gln-Trp、Trp-Asp-Gln-Trp-Trp-Trp和Trp-Asp-Gln-Trp-Cys-Ile-Trp,能够显著增强XO抑制活性和抗氧化活性。在体外模拟消化中,核桃蛋白肽PPKNW经受胃蛋白酶和胰蛋白酶连续作用4 h之后仍然未完全降解,具有一定的稳定性。核桃蛋白肽PPKNW和WPPKN对小鼠灌胃后,小鼠血清的XO抑制活性明显增强。其中,多肽PPKNW灌胃后血清的XO抑制活性呈现出灌胃剂量依赖性。此外,PPKNW高剂量和WPPKN低剂量灌胃后,血清的ORAC活性明显增强。本研究表明脱脂核桃粉具有一定的降尿酸功效,并证实核桃蛋白肽有的同时具有XO抑制和抗氧化作用,为核桃蛋白肽和结构改良设计肽作为潜在的降尿酸肽提供一定的实验和理论依据,同时有利于扩展核桃蛋白肽潜在的应用范围,提高其经济附加值。因此,利用核桃蛋白肽进一步开发降尿酸功能食品,对改善高尿酸血症、痛风以及氧化应激相关疾病具有重要意义。