本研究根据GenBank已收录的A/Swine/Heilongjiang/1/05(H3N2)分离株血凝素基因序列,设计一对引物,用RT-PCR扩增H3N2亚型猪流感病毒HA1基因。将该片段定向插入到原核表达载体pET-30a(+)中,构建原核表达载体pET-HA1。阳性质粒转化宿主菌BL21,经IPTG诱导,HA1基因获得表达,重组蛋白以包涵体的形式存在。通过改变IPTG的浓度和诱导时间,确定表达HA1基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.8mmol/L,诱导时间为4 h。表达产物经SDS-PAGE分析,结果显示H3N2亚型猪流感病毒HA1基因在原核表达系统中已表达,HA1蛋白表达量占细胞总蛋白的40%分子量近似42KD。Western blot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。用纯化的表达产物作为诊断抗原建立了检测H3亚型猪流感病毒抗体的间接ELISA方法,确定抗原最佳包被浓度为3.75μg/ml,血清最佳稀释度为1:100,酶标HRP的最适工作浓度为1:1000。阳性标准初步判定为:OD490nm≥0.254。该检测方法不与H1N1、H5N1, H3N2亚型猪流感病毒及猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病等猪病的阳性血清发生交叉反应。与HI作对比实验,同时对来自不同地区患有呼吸道疾病的309份现地猪血清进行检测,检测结果表明ELISA方法的特异性和敏感性都较高,并且两者的符合率达到89%以上,建立的间接ELISA方法为H3亚型猪流感病毒抗体检测提供了快速、准确、简便的方法。研究采用猪流感病毒(SIV)H3N2亚型A/Swine/Guangdong/164/06(H3N2)(SGD/16406)毒株作为免疫原,免疫8周龄BALB/C雌性小鼠,三次加强免疫后取脾细胞与SP2/0细胞融合,利用全病毒包被ELISA方法检测筛选,阳性细胞克隆经有限稀释法克隆培养,最后获得H3亚型特异性McAb四株:D4E11、B8G6、B8H5、C8G8。以纯化的SIV(SGD/16406)为抗原对得到的4株单抗进行Western blot分析,4株单抗均在约56KD出显示单一条带。故判定4株单抗为针对NP蛋白的单克隆抗体。四株NP蛋白特异性McAb效价(ELISA效价)依次为:1:32000、1:32000、1:8000、1:16000。染色体计数分析各株杂交瘤细胞的平均染色体数均在98-106之间,符合脾细胞与SP2/0细胞染色体数之和。亚类检测结果:B8G6、B8H5为IgG2b,C8G8、D4E11为IgM。4株单抗经间接ELISA检测均不与猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病毒反应,具有一定的型特异性。