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第一部分c-FLIP在黑素瘤组织中的表达及其与临床病理特征的关系目的检测c-FLIP在黑素瘤组织及细胞系中的表达,探究其与临床病理特征之间的关系。方法免疫组化方法检测c-FLIP在77例黑素瘤组织及23例色素痣组织中的表达；并检测其在34例CA和16例正常包皮组织中的表达,同时用western blotting和RT-PCR检测了其分别在CA和正常包皮组织中的蛋白表达和mRNA水平。western blotting和流式细胞术检测c-FLIP在A375, A875, SK-Mel-1和SK-Mel-28黑素瘤细胞系中的表达。结果c-FLIP在恶性黑素瘤组织中的表达明显高于在色素痣中的表达,其高表达与组织病理学分型相关并与黑素瘤的Clark’s分级相关。与Ki-67标记指数(KI)高度相关。四株黑素瘤细胞中,A875细胞的c-FLIP的表达最高。c-FLIP在CA中的蛋白和mRNA水平均较正常包皮组织中的明显增高。结论c-FLIP除了具有抗凋亡功能外,它还具有促增殖作用,在恶性黑素瘤的侵袭性生物学特性中可能具有重要的作用,对恶性黑素瘤的预后具有重要意义。c-FLIP在CA中的高表达可能与角质形成细胞的过度增殖有关。第二部分c-FLIPshRNA载体的构建及鉴定目的构建针对c-FLIP不同亚型的shRNA真核表达载体c-FLIPT/L/S shRNA,鉴定其正确性,并转染恶性黑素瘤A875细胞系,证实其在体外培养的恶性黑素瘤细胞中对c-FLIP具有干扰作用。方法①人工合成互补并编码相应短发夹状c-FLIPT/L/S shRNAs的寡核苷酸链,将其插入到Pgenesil-1载体中,经酶切和测序鉴定所构建的重组体是否正确；②采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot和流式细胞术分别检测转染的A875细胞中c-FLIP mRNA和蛋白的表达变化。③在人恶性黑素瘤细胞系A875中,用G418筛选沉默效果最佳的c-FLIPshRNAs,用流式细胞术(FCM)检测GFP的表达,鉴定稳定转染的单克隆细胞系。结果①经酶切和测序证明c-FLIPT/L/S shRNAs序列正确；②A875细胞系中转染c-FLIPT/L/S shRNAs载体后,c-FLIPT1shRNA和c-FLIPT1shRNA沉默效果最佳。③荧光显微镜下观察到了G418筛选稳定表达c-FLIPT1shRNA的A875细胞,FCM检测GFP表达均在96%以上。结论测序结果表明发卡样的c-FLIPT/L/S shRNAs真核表达载体构建成功,转染A875细胞后获得稳定表达,并可特异性封闭c-FLIPT/L/S的表达,筛选和鉴定出稳定转染单克隆细胞系A875,为后续实验及进一步研究c-FLIPT/L/S shRNAs载体在恶性黑素瘤治疗中的作用提供了理论基础。第三部分c-FLIP的下调诱导恶性黑素瘤A875细胞系JNK信号途径的活化目的观察c-FLIP不同亚型shRNA对恶性黑素瘤A875细胞系JNK信号途径的影响。方法western blot检测c-FLIPT/L/S shRNAs真核表达载体稳转的A875细胞系中p-JNK表达水平。结果与未转染质粒的A875细胞和稳定转染c-FLIPC shRNA真核表达载体的A875细胞相比,c-FLIPT/LshRNAs真核表达载体稳定转染的A875细胞系中p-JNK表达水平明显升高,而c-FLIPS-shRNA真核表达载体稳转的A875细胞系中p-JNK表达水平无明显变化。结论在黑素瘤细胞系中下调c-FLIP (c-FLIPL)的表达可以诱导JNK信号途径的活化。第四部分c-FLIP不同亚型shRNA对恶性黑素瘤细胞生物学特性的影响目的观察c-FLIP各亚型shRNA对A875细胞的生长、增殖及凋亡的影响。方法在c-FLIPT/L/S/C shRNA稳定转染A875细胞中,运用绝对细胞计数对c-FLIP各亚型shRNA稳定转染细胞绘制生长曲线,比较其与对照组的差异；用MTT法检测各稳定转染细胞增殖能力的差异；用Annexin v/PI双染细胞,检测各组细胞凋亡率的差异。结果稳定转染c-FLIPT/L/sshRNAA875细胞生长速度较未转染质粒的A875细胞和稳定转染c-FLIPC shRNA A875细胞的生长速度慢,进入对数生长期的时间延长且平台降低。与未转染质粒的A875细胞和稳定转染c-FLIPC shRNA真核表达载体的A875细胞相比,稳定转染c-FLIPT/L/S shRNA真核表达载体的A875细胞光密度值明显降低。运用Annexin v/PI双染,流式细胞术检测细胞凋亡显示与未转染质粒的A875细胞和稳定转染c-FLIPc shRNA真核表达载体的A875细胞相比,稳定转染c-FLIPT/L/S shRNA真核表达载体的A875细胞凋亡率明显增加。结论靶向c-FLIP基因不同亚型的shRNA不仅对黑素瘤细胞的生长和增殖具有抑制作用,而且能够促进黑素瘤的凋亡。