背景:口腔再生医学研究的蓬勃发展为口腔疾病的治疗带来了新的希望。生物材料作为再生医学的基本要素之一,为细胞的粘附增殖提供支持、为组织的再生重塑提供模板,在外源性和内源性两种再生策略中都发挥着重要作用。生物材料植入体内后,对免疫细胞(例如巨噬细胞、CD4~+T细胞等)和对组织形成细胞(例如干细胞、前体细胞等)的调控直接影响着组织再生的效果和结局。近年来,免疫调节型生物材料(具有免疫调节功能的生物材料)的研发吸引了本领域学者的广泛关注。不同类型的生物材料包括无机材料、有机高分子材料、天然生物材料等植入体内后,都不同程度引发不利于组织再生的免疫反应。因此,探索如何通过改善材料的理化生特性,来优化材料免疫调节性能,对于新型免疫调节型生物材料的研发具有重要意义。研究表明,除了化学成分和细胞因子控释效果等受到广泛关注的材料特性外,材料物理性能在机体免疫反应调节方面也起到关键作用。课题组前期研究结果也表明,在化学成分一致但硬度不同的水凝胶体系中培养的巨噬细胞结局和命运完全不同。为进一步揭示材料物理性能对其免疫调节功能的影响,本课题聚焦表面形貌和物理状态两个关键环节,从细胞行为、功能和转录组水平系统探索材料物理性能对巨噬细胞和对组织再生的调节作用。细胞外基质(ECM)衍生生物材料是由天然组织经脱细胞处理得到的生物材料或是利用ECM一种或多种组分借助工程学手段制得的生物材料,具有与天然ECM相似的化学成分和优良的生物学性能,一方面作为生物材料可以直接用于多种组织再生治疗,另一方面作为研究工具,被广泛用于材料平台研制,为深入探索一些复杂的细胞生物学活动提供了可能。本课题选用明胶和脱细胞骨外基质两种ECM衍生生物材料,分别探索材料表面形貌和物理状态对巨噬细胞(和干细胞)的影响,可以减少研究过程中,材料化学性能对结果的干扰。系统、深入阐述材料物理性能对免疫细胞的调节和对组织再生的影响,既是免疫调节型再生生物材料研制的必由之路,也可为新型免疫治疗技术和手段的开发提供参考和借鉴。1.材料表面形貌对巨噬细胞极化的影响【目的】表面形貌是材料重要的物理特征。不论材料的宏观形式如何变化,细胞与材料接触瞬间就会感知材料表面形貌特征,继而启动相应的生物学应答。本部分旨在探究ECM衍生生物材料的表面形貌对巨噬细胞极化状态的影响。【方法】以明胶(胶原水解产物)为原料,分别借助静电纺丝和流延风干两种技术制备纳米纤维形貌和光滑形貌的明胶支架。通过扫描电镜、实时定量PCR、免疫荧光染色、流式多因子检测、转录组测序等手段,以细胞系RAW264.7为巨噬细胞模型,评估不同形貌的明胶支架对巨噬细胞形态、极化指标表达、炎性因子分泌、转录水平的影响。【结果】巨噬细胞在纳米纤维支架表面和在光滑支架表面相比伸展面积更小,保持单核细胞球形形态的比例更大,但粘附细胞数量更多。纳米纤维支架上的巨噬细胞与光滑支架上的巨噬细胞相比,M1极化指标iNOS的mRNA和蛋白表达水平显著下降,且不受干细胞调控的影响;M2极化指标MMR的mRNA和蛋白表达水平也有所减弱,但在干细胞调控下此现象消失。两种形貌明胶支架上的巨噬细胞培养上清液炎性因子分泌水平在培养24 h时尚无显著差异。转录组分析结果显示,与光滑支架表面的巨噬细胞相比,纳米纤维支架表面的巨噬细胞NF-κB信号通路、NOD样受体信号通路以及与微生物感染相关通路总体呈现下调状态。【结论】ECM衍生生物材料纳米纤维形貌与光滑形貌相比显著减弱巨噬细胞M1极化水平、下调炎症反应相关通路,但对巨噬细胞M2极化没有促进作用,在相关材料设计中需添加诱导M2极化的因素。2.明胶支架纳米纤维形貌调控细胞行为的实验研究【目的】天然组织的ECM是由以胶原蛋白为主要成分建构而成的纳米纤维网络。由于明胶纳米纤维支架在化学成分和物理结构两方面都十分接近天然ECM,因此是一种理想的支架材料,在再生医学领域极具前景。在第一部分研究的基础上,本部分采用活体组织分离培养的细胞,排除细胞系永生化基因改造可能存在的影响,以期验证第一部分巨噬细胞相关研究的结论,并进一步探索明胶支架纳米纤维形貌对干细胞行为的调控作用。【方法】以大鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)为原代巨噬细胞模型,通过扫描电镜、实时定量PCR、免疫荧光染色等手段研究纳米纤维形貌对BMDM的调控作用;以人牙髓干细胞(DPSC)为干细胞模型,通过扫描电镜、免疫荧光染色和转录组测序等手段研究纳米纤维形貌对DPSC的调控作用。【结果】明胶支架纳米纤维形貌显著抑制BMDM的M1极化指标iNOS的表达,不受干细胞调控参与的影响;纳米纤维形貌对BMDM的M2极化指标MMR没有显著影响。纳米纤维形貌明胶支架表面的DPSC有丝分裂和细胞衰老相关基因转录水平下降,骨向分化和神经突触结构相关基因转录水平上升。KEGG通路富集分析显示,DPSC在纳米纤维表面培养时TGF-β信号通路和干细多能性调控信号通路总体呈现上调趋势。【结论】明胶纳米纤维形貌对BMDM的行为影响与巨噬细胞系相比略有差异,但仍然显著抑制M1极化,进一步验证了细胞系相关实验中得到的结论。纳米纤维形貌的明胶支架由于具有抑制干细胞有丝分裂的趋势,故不适宜用于体外扩增细胞,但是可以考虑作为人工ECM用于暂时保存干细胞、延缓细胞衰老、维持细胞多能性等。3.材料物理状态对巨噬细胞和组织再生的影响【目的】组织器官经过脱细胞处理得到的ECM材料保留了来源组织的物理特性与生化信号,在促进组织再生方面具有天然优势。不同组织来源ECM引起的巨噬细胞反应不尽相同进而会影响其促进再生的效果。针对临床上常用的颗粒状脱细胞骨外基质(B-ECM)材料倾向于引起巨噬细胞M1型极化反应且对骨缺损的修复效果难以预测的问题,本研究拟通过改变B-ECM材料的物理状态来调控巨噬细胞极化反应,以达到促进组织再生的目的。【方法】经过一系列脱钙、脱细胞、冻干、冷冻研磨等处理制备B-ECM颗粒;通过蛋白酶消化、中和、冻干、再水化、风干等步骤实现颗粒-凝胶转换,得到B-ECM凝胶。利用扫描电镜、ATR-FTIR、原子力显微镜等手段对B-ECM颗粒与凝胶的表面形貌、表面化学成分、杨氏模量等进行比较;利用扫描电镜、实时定量PCR、NO合成检测、ELISA等方法研究两种物理状态B-ECM对BMDM极化状态的影响;利用CCK-8增殖实验、ALP胞内染色与胞外活性定量、实时定量PCR等方法研究二者对骨髓间充质干细胞(BMMSC)增殖分化的影响;最后利用大鼠口内入路的牙周骨缺损模型对比二者在促进牙周再生方面的潜能。【结果】B-ECM凝胶呈现出纳米纤维交织网络状表面形貌且杨氏模量显著低于B-ECM颗粒,但二者表面化学成分基本相同;在B-ECM颗粒表面培养的BMDM倾向于M1极化,而在B-ECM凝胶表面培养的BMDM倾向于M2极化;两种物理状态的B-ECM材料均可以支持BMMSC的增殖与骨向分化;B-ECM凝胶促进牙周骨缺损修复的效果略好于B-ECM颗粒,但仍有很大改善空间。【结论】通过颗粒-凝胶转换改变B-ECM材料的物理状态,可以调控巨噬细胞极化反应向有利于再生的方向发展。这种简便易行、经济实用的策略对各种脱细胞ECM材料在组织再生领域中的应用具有借鉴意义。