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众所周知，骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic syndrome，MDS）难治，尤其是高危MDS。原因可能与MDS恶性克隆对药物作用的敏感性降低有关。目前，MDS的治疗目的是消除或减少瘤细胞克隆，部分或完全重建正常造血，或诱导异常细胞向正常细胞分化成熟。为研究MDS细胞对药物治疗的反应，我们引进了对各种常用的分化诱导剂均无反应的MDS-RAEB型细胞株MUTZ-1。已有研究表明，以拓扑异构酶Ⅱ为作用靶点的第二代蒽环类抗肿瘤药物——阿克拉霉素（aclacinomycin，ACM）治疗某些MDS患者有效。体外实验研究表明，与其它的抗肿瘤剂相比，更不容易产生耐药性，其机理尚不明确。本文旨在研究ACM对MDS-RAEB型细胞株MUTZ-1细胞的体外治疗效应及其新的作用机理。试图证明ACM可诱导MUTZ-1细胞凋亡及（或）向成熟分化，以减少MDS恶性克隆；并试图阐明ACM抗MDS细胞的又一分子机制，从而为克服MDS细胞对化疗药物的耐受寻找新的治疗靶点，为设计新的治疗策略拓宽思路。 采用MTT比色法检测结果显示，0.05μmol/L ACM处理48h，即明显抑制MUTZ-1细胞的增殖，与空白对照组相比，差别有统计学意义（p＜0.05）。ACM作用48h的半数抑制浓度(IC50)为0.46μmol/L。为探讨这种抑制作用的机制，我们从细胞凋亡及细胞分化两个层面作了进一步的研究。 在体外，本研究采用瑞特-姬姆萨染色，光学显微镜观察ACM作用前后MUTZ-1细胞形态，结果显示，0.5μmol/L ACM处理后，MUTZ-1细胞出现凋亡细胞典型的形态学特征， 浙江大学博士学位论文如胞浆空泡化，细胞体积缩小，核染色质固缩，核边聚，染色质断裂，出芽，凋亡小体形成等（图I－2）。 为了对细胞凋亡现象进行准确地定性或定量分析，我们采用多种经典、特异而敏感的实验指标，并利用近年来发展起来的流式细胞分析技术研究了细胞DNA含量、亚二倍体及磷脂酞丝氨酸（PS）转位。结果显示，0．25Pmol／L－0．SPmol／L ACM作用 48h，可见典型的 DNA梯形条带：采用 DNA片断原位末端（TLINEL法）标记方法证明，在一定的作用时间点，随ACM浓度的增加，TUNEL阳性细胞也增加；一定的药物浓度范围内，随ACM作用时间延长，TUNEL阳性细胞增加。从生物化学角度进一步证明，在体外，ACM能诱导MUTZ—l细胞凋亡，且呈剂量一，时间一效应依赖关系。 采用流式细胞仪分析技术探讨了ACM作用前后MUTZ－1细胞DNA含量及亚二倍体的改变。结果显示，0．in mol／L l．2卜mol／L ACM处理后，MUTZ－1细胞周期 G。／M期细胞增多，GllG。期细胞减少，细胞被阻滞于GZ／M期。同时亚二倍体细胞增多，MUTZ－l细胞亚GI期峰更明显(图1．小表明，ACM可能通过阻滞MUTZ－l细胞于细胞周期的GZ／M期，最终导致MUTZ－l细胞凋亡。进一步采用AnnexinV－PI双标记法流式细胞仪分析，结果显示，o．印(、！几＊＊M作用36h，早期凋亡细胞百分数(2！．83叨高于空白对照组（3．n叨；晚期凋亡细胞在处理组仅稍高于空白对照组（厂9％VS 2．65％）。表明，一定浓度 ACM作用一定时间，主要是诱导MUTZI细胞发生早期凋亡（图1．8）。 为研究ACM诱导MUTZ－！细胞凋亡的可能机制及信号传导途径，本研究采用转染报告基因载体pNF。B－SEAP后化学发光测定法分析ACM作用前、后核转录因子NF。B活性水平，并用 RT－PCR法在转录水平检测其调控的靶基因 clAPI及 clAPZ mRNA表达的改变；WCstern blot法检测 ACM作用前、后 NF。B抑制蛋白质 I。B a水平表达的改变，并探讨了ACM较少产生耐药性的可能原因。 研究结果显示，一定浓度 ACM（0．5 u mol／L）处理 MUTZ－l细胞不同时间（3h、6h、12h、24h），导致了抗凋亡基因 clAP－l、cIAPZ mRNA表达水平以时间依赖的方式降低，并与MUTZ－l细胞TUNEL阳性细胞百分数呈负相关（rs－0．991，－0．975）；不同浓度ACM（0三卜mol／L十0 u mol／L）处理 24h，可引起 MUTZ－l细胞 cIAPI、cIAPZ mRNA表达以浓度依赖的方式下调，并与其TUNEL阳性细胞百分数呈负相关（，－0．984，－0．951）。说明ACM诱导MUTZ－l细胞凋亡与抗凋亡基因 clAPI、cIAPZ mRNA表达下调有关。 3 浙江大学博土学位论文 迢过瞬时转染报告基因载体pNF。B－SEAP后化学发光法检测培养上清液中报告基因表达产物 SEAP活性，其活性代表相应转录因于 NF。B活性。结果显示，0．sapOUL ACM作用 3h，MUTZ一！细胞 SEAP活性（8．72土 2．88）较同一时间点空白对照组（1184士 3．11）的为低（cd．2 12，Pq）刀42）；0．SPmol／L ACM作用 6h时，MUTZ—l细胞 SEAP活性与在相应时间点的空白对照间的差异非常显著（P＜0刀1），0．5卜m＊儿＊＊M作用至24卜时，细胞％AP活性己降至相应空白对照组的二．9％。因此，0．5卜mol／L ACM作用 MUTZ—l细胞 3－24h，以时间依赖方式抑制报告基因SEAP活性，当0门卜mol／L ACM处理24h，MUTZ—l细胞SEAP活性(11．84士2．67?