[目 的]探究肌动蛋白结合蛋白2（Transgelin-2,TAGLN2）在结直肠癌增殖、侵袭和迁移中的作用,并阐明其调控Notch-1信号通路和交互白细胞分化抗原44（CD44）促进结直肠癌发生发展的机制,进一步丰富结直肠癌分子治疗的理论基础。[方 法]1.全转录组测序及生物信息学分析筛选目的基因收集昆明医科大学第三附属医院2018年3月至2020年7月间结直肠癌癌组织73例、癌旁组织73例及肝脏转移癌组织13例,其中结直肠癌癌组织、癌旁组织和肝转移组织各13例行全转录组测序,60例癌组织和60例癌旁组织行HE染色和IHC。对转录组测序数据进行差异分析,并将差异表达的基因构建蛋白-蛋白互作网络（Protein-protein interaction network,PPI）,根据Degree度对高表达的基因进行排序筛选出Top 10 hub基因,根据排序顺序初步筛选出研究的目标基因。再进一步通过生物信息学分析目标基因在结直肠癌中的表达水平及与结直肠癌预后的关系;并通过qRT-PCR、WB和IHC等实验验证筛选的目标基因在结直肠癌中的表达水平,最终选定研究的目标基因TAGLN2。2.探索目标基因TAGLN2对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用①通过qRT-PCR和WB实验检测目标基因TAGLN2在正常肠上皮细胞NCM-460与结直肠癌细胞株（HCT-116、HT-29、RKO）间的表达差异。②构建TAGLN2-siRNA,转染结直肠癌细胞,并采用qRT-PCR和WB实验验证其转染效果。③转染成功后,分别采用CCK8、EdU、平板克隆实验检测细胞的增殖能力;采用划痕实验、Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力。④构建TAGLN2重组慢病毒过表达质粒,侵染三株结直肠癌细胞,通过平板克隆实验检测细胞的增殖能力;并将TAGLN2过表达和阴性对照的HCT-116细胞株行裸鼠皮下荷瘤实验,观察TAGLN2过表达对裸鼠荷瘤生长情况的影响,并对荷瘤组织进行HE染色。3.探索目标基因TAGLN2促进结直肠癌发生发展的机制①采用生物信息学深入挖掘TAGLN2促进CRC细胞增殖的机制发现TAGLN2与Notch-1信号通路有关,沉默TAGLN2表达后通过WB实验及免疫荧光实验检测Notch-1信号通路相关蛋白的表达变化;将荷瘤组织进行IHC实验观察过表达TAGLN2在体内实验中对交互蛋白及Notch-1信号通路相关蛋白表达的影响。②用WB实验检测在Notch-1受体激动剂Jagged-1激活Notch-1信号通路后加入TAGLN2-siRNA后TAGLN2及Notch-1信号通路相关蛋白表达变化。③根据质谱分析及Top10 hub基因排序结果,分析与TAGLN2可能存在交互作用的蛋白,并通过免疫共沉淀实验验证二者是否结合。然后沉默TAGLN2表达后观察可能交互蛋白的表达变化;沉默交互蛋白表达后观察TAGLN2的表达变化;同时沉默TAGLN2和交互蛋白观察Notch-1信号通路相关蛋白表达的变化;过表达TAGLN2后观察可能交互蛋白的表达变化;行免疫荧光实验探究二者在细胞膜的共同定位。④用WB实验检测过表达TAGLN2的结直肠癌细胞中交互蛋白及Notch-1信号通路相关蛋白表达的变化情况。⑤运用生物信息学分析挖掘交互蛋白CD44在结直肠癌中的表达情况:用IHC验证在新鲜结直肠癌组织中CD44的表达情况;用WB实验检测CD44在结直肠癌细胞中的表达情况。⑥构建CD44-siRNA,转染结直肠癌细胞,并采用qRT-PCR实验验证其转染效果。转染成功后,分别采用CCK8、EdU、平板克隆实验检测细胞的增殖能力;采用划痕实验、Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力。[结果]1.筛选TAGLN2作为研究的目标基因全转录测序数据分析显示,结直肠癌组织、肝转移癌组织和癌旁组织之间差异表达交集基因共858个,构建PPI网络后,采用Degree度排序发现TAGLN2位列第一。进一步检索TCGA和GTEx数据库显示,与正常组织相比,结直肠癌组织中TAGLN2的表达显著上调,且TAGLN2高表达的患者往往伴随着较低的总体生存率。qRT-PCR、WB实验结果显示,较癌旁组织相比,结直肠癌组织中TAGLN2表达明显上调（p＜0.01）。HE染色显示结直肠癌组织细胞排列紊乱,核质比明显高于癌旁组织,IHC显示TAGLN2在结直肠癌组织中的表达明显增加。故本研究选定TAGLN2作为研究的目标基因。2.TAGLN2可以促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭①与正常肠上皮细胞NCM-460相比,TAGLN2在结直肠癌细胞株HCT-116和RKO中的表达显著增加（p＜0.001）,在HT-29中表达也增加（p＜0.01）。②TAGLN2-siRNA转染HCT-116、HT-29和RKO三株结直肠癌细胞后,qRT-PCR和WB结果显示,与未转染相比,转染后TAGLN2表达水平明显下降（p＜0.01）。③CCK8实验结果显示,沉默TAGLN2基因表达的结直肠癌细胞的增殖能力下降（p＜0.01）;克隆实验显示沉默TAGLN2表达后,结直肠癌细胞的细胞集落减少且体积减小（p＜0.01）,而过表达TAGLN2的结直肠癌细胞株细胞集落增加体积增大（p＜0.001）;EdU实验显示,在沉默TAGLN2基因表达的结直肠癌细胞中,EdU 阳性细胞比例减少（p＜0.001）;划痕实验表明TAGLN2基因沉默后结直肠癌细胞迁移能力显著下降（p＜0.001）。Transwell实验结果显示下调TAGLN2表达减少了穿过聚碳酸酯膜的细胞,抑制了结直肠细胞的侵袭能力（p＜0.001）。④过表达TAGLN2可显著促进荷瘤组织生长,肿瘤体积和肿瘤重量与NC组相比具有统计学差异（p＜0.01）。HE染色显示,较NC组相比,TAGLN2过表达组的组织细胞排列紊乱,核质比增高。3.TAGLN2交互CD44调控Notch-1信号通路促进结直肠癌发生发展①基于转录组测序数据,采用KEGG分析发现,Notch-1信号通路在结直肠癌发生发展中发挥了重要作用,且与TAGLN2相关。进一步行质谱和细胞功能富集分析发现TAGLN2具有靶向细胞周期和粘附体连接功能,这些功能与Notch-1信号通路密切相关;WB实验显示,沉默TAGLN2表达后,结直肠癌细胞中Notch-1表达下调,且其下游基因Hes-1和RBPSUH也随着Notch-1的表达下降而下调（p＜0.001）;免疫荧光实验结果显示抑制TAGLN2表达,Notch-1荧光表达强度降低;裸鼠荷瘤组织的IHC显示,TAGLN2过表达后Notch-1和Hes-1表达增加。较NC组相比,阳性细胞比率、阳性细胞密度、H-Score评分和阳性得分结果均具有统计学差异（p＜0.05）。②WB结果显示加入Notch-1受体激动剂Jagged-1后Notch-1信号通路被激活,但再加入TAGLN2-siRNA后激活的Notch-1信号通路其相关蛋白表达下调（p＜0.001）。③根据Degree度对构建的PPI网络中的基因进行Top10 Hub基因排序,发现TAGLN2和CD44分别位列第一位和第二位;进一步检索TCGA数据库发现TAGLN2和CD44在CRC组织中共富集,且二者表达呈中度相关（Cor=0.62）;TAGLN2免疫共沉淀实验结果显示TAGLN2与CD44蛋白相结合,二者可能具有交互作用;沉默TAGLN2后WB实验结果显示CD44的表达下调（p＜0.001）,沉默CD44后TAGLN2表达亦下调（p＜0.001）;同时沉默HT29细胞的TAGLN2和CD44,WB结果显示Notch-1、Hes-1和RBPSUH的表达下降,且Cleaved Notch-1表达显著下降（p＜0.001）;TAGLN2过表达的结直肠癌细胞中CD44表达上调（p＜0.001）。免疫荧光共定位显示TAGLN2和CD44共同表达于细胞膜。裸鼠荷瘤组织免疫组化染色显示,TAGLN2过表达后CD44表达增加,较NC组相比,阳性细胞比率、阳性细胞密度、H-Score评分和阳性得分均具有统计学差异（p＜0.05）。④过表达TAGLN2后,结直肠癌细胞中CD44表达上调,Notch-1表达也上调,且其下游基因Hes-1和RBPSUH的表达亦上调（p＜0.001）。⑤检索TCGA和GTEx数据发现,结直肠癌组织中CD44的表达显著上调;IHC和WB实验结果显示CD44在结直肠癌细胞中高表达（p＜0.01）。⑥qRT-PCR 实验显示 siRNA 能抑制 CD44 表达（p＜0.00l）。CCK8、克隆和EdU实验显示沉默CD44表达可抑制结直肠细胞增殖（p＜0.001）;划痕实验显示沉默CD44表达能抑制结直肠癌细胞迁移能力（p＜0.001）。[结 论]1.TAGLN2、CD44促进结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移。2.TAGLN2可能通过调控Notch-1信号通路促进结直肠癌的增殖、侵袭和迁移。3.TAGLN2与CD44结合并相互作用,二者相互作用可能促进结直肠癌进展。