白血病是一种常见的严重危害人类健康的造血系统恶性肿瘤。据统计,全世界约有250,000人患上了白血病。不幸的是,仍有大部分白血病病人死于耐药和复发。然而,迄今为止,由于白血病的确切病因和发病机制仍未明确,使得研发能够有效能治愈该类疾病的药物和治疗方案成为当下一直未能攻克的难题。长久以来,在病毒、电离辐射、化学物质和遗传因素等病因学的研究中,由以病毒病因学的研究最为引入注目。多年来研究证明,逆转录病毒是一些动物白血病和成人T细胞白血病/淋巴瘤的直接病因。然而,逆转录病毒是否是引起人常见白血病如：人急/慢性髓细胞白血病、人急/慢性淋巴细胞白血病的病因却未见明确报道。HERV-K是人内源性逆转录病毒家族成员中最可能具有生物学活性和致病性的一员。近年来陆续有研究报道HERV-K家族成员在许多人肿瘤中被再次激活。甚至有个别研究者在肿瘤病人中发现了HERV-K的病毒颗粒和抗HERV-K的抗体。人内源性逆转录病毒基因Np9是Ⅰ型HERV-Kenv基因编码和剪辑的产物。研究证明,Np9的转录本只在肿瘤细胞和转化的细胞中表达,而在正常的非转化的细胞中不表达。这高度提示着Np9转录的激活与肿瘤的形成密切相关。然而,现有的研究尚不明确Np9蛋白在肿瘤中的表达情况及功能。我们的前期研究已经证明,在急性髓细胞白血病病人的原代白血病细胞中存在典型的逆转录病毒颗粒。并且,现有的研究证实由Ⅰ型人T细胞白血病病毒编码的Tax蛋白与该病的发病相关。这为我们探究人内源性逆转录病毒HERV-K Np9蛋白在人白血病中的表达及功能提供了思路和基础。本论文将通过以下三部分重点探讨Np9蛋白在人白血病细胞系、病人中的表达情况、功能及具体的分子机制。这对揭示白血病病因和深入理解发病机制有重要意义,并有可能为人白血病的诊断和防治带来新的思路。第一部分Np9蛋白在人白血病中的表达研究本部分旨在明确Np9蛋白在人白血病细胞系、白血病病人原代标本以及正常成年人中的表达情况。并在此基础上进一步了解与Np9相关的同由Ⅰ型HERV-Kenv基因编码的pol-env、env和transmembrane蛋白的表达情况。最后还将探讨激素、酒精、DNA去甲基化剂和病毒诱导剂等因素对诱导白血病细胞中Np9激活的影响。我们收集了14种人恶性血液肿瘤细胞系和16种实体瘤细胞系,通过Western blot及抗Np9的特异性抗体检测各细胞中Np9蛋白的表达情况。结果显示：78.57%的人恶性血液肿瘤细胞系高表达Np9蛋白(11/14)。其中包括3种慢性髓细胞白血病细胞系：K562, K562/adr, KCL-22M;3种急性髓细胞白血病细胞系：HL-60, NB4, Kasumi-1;3种急性淋巴细胞白血病细胞系：Jurkat, Molt-4, H9;2种多发性骨髓瘤细胞系：8226,KM3。18.75%实体瘤细胞系(3/16)。其中包括：人恶性胶质瘤细胞系：U87；人肺癌细胞系：A549；人胰腺癌细胞系：PANC-1。我们接着收集了50例白血病病人及22例正常成年人的外周血标本,通过淋巴细胞分离液分离单个核细胞,并用Western blot检测了Np9蛋白的表达情况。结果显示：56%原代白血病病人标本表达Np9蛋白(28/50)。相比之下,4.5%正常成年人弱表达Np9蛋白(1/22)。综上结果：Np9蛋白在人白血病细胞系和白血病病人的原代细胞中普遍表达,而在正常人的血细胞中几乎不表达。我们结合上一部分的实验结果及病人临床资料,对Np9蛋白水平与CD34+白血病干/祖细胞的相关性进行统计分析。结果发现,Np9蛋白水平可能与CD34+白血病干/组细胞正相关(P=0.003)。我们进一步选择Np9蛋白阳性的白血病标本并应用Western blot技术检测与Np9相关的同由Ⅰ型HERV-Kenv基因编码的其它逆转录病毒蛋白pol-env、env和transmembrane蛋白。结果显示,Np9蛋白阳性的样本高表达白血病特异的pol-env、 env和transmembrane蛋白,而正常成年人外周血分离的单个核细胞却未见表达。接着我们通过实时定量PCR技术测定了激素、酒精、DNA去甲基化剂和病毒诱导剂等因素对白血病细胞中Np9转录的影响。结果显示,随着Dexamethasone、酒精、IdUR浓度的增高,Np9的转录水平逐渐提高；5-Aza浓度的变化未见明显影响。第二部分Np9蛋白在体内和体外对白血病细胞生存与增殖的影响本部分研究通过体外细胞系实验和体内动物模型的建立,旨在揭示Np9蛋白对白血病细胞生存和增殖的影响,明确其是否是白血病细胞生存和增殖的必须因素。应用shRNA和慢病毒感染技术稳定下调了人慢性粒细胞白血病细胞系K562和人急性淋巴细胞白血病细胞系Jurkat中Np9蛋白的表达水平,并随后用MTS实验检测细胞增殖能力的变化。结果发现,两种细胞的生长都受到了明显的抑制。相应地,利用慢病毒感染技术在Np9蛋白阴性的人B淋巴细胞白血病细胞系Raji稳定地过表达Np9蛋白,通过测定和绘制细胞的生长曲线发现过表达Np9蛋白的Raji细胞的增殖能力要明显高于对照组。为了进一步评估Np9的表达对白血病细胞克隆形成能力的影响,应用上一步已建立的Raji-Np9和Raji-Ctr这两种细胞的克隆形成实验来观察所形成的克隆数量及大小的差异。结果显示,上调Np9蛋白的表达水平能显著增加Raji细胞的克隆形成数量和大小。接着通过脂质体转染技术将p-EGFP-C1-Np9和p-EGFP-C1瞬时转入人慢性粒细胞白血病细胞系K562。应用激光共聚焦显微镜观察Np9蛋白的亚细胞定位,发现该蛋白主要分布细胞核内,但是仍有一小部分分散在胞浆。为了明确Np9蛋白能否在体内促进白血病细胞的生长,我们将过表达Np9蛋白的Raji细胞经皮下注射到严重联合免疫缺陷的NOD-SCID鼠中,同时用转染空载体的Raji细胞作为阴性对照,Rec蛋白作为阳性对照,发现由Raji-Np9所形成的肿瘤生长速度要显著高于阴性对照组(*P<0.01)。25天以后,瘤重约为1.74g±0.42g,而相应的阴性对照组为0.62g±0.18g(*P<0.01)。实验组的瘤重约为阴性对照组的2.81倍。Real-time PCR分析结果显示,Np9蛋白在相应的细胞系和移植瘤中高表达。综上结果我们认为Np9蛋白是白血病细胞生存的必须因素,并且能够显著促进白血病细胞的复制、增殖和产生子代的能力。第三部分Np9蛋白促进白血病细胞增殖的分子机制研究本部分研究重点对白血病中常异常激活的Numb/Notch、Ras/ERK1/2、 c-myc/AKT和Wnt/β-catenin信号通路与Np9蛋白表达的相关性做出分析,并且结合Np9蛋白的氨基酸序列特征分析和功能域预测,以揭示Np9蛋白促进白血病细胞增殖的分子机制。我们首先选取了高表达Np9蛋白的四种白血病细胞：K562、Kasumi、NB4和Jurkat,并同时通过Western blot技术检测了Numb/Notch、Ras/ERK1/2、c-myc/AKT和Wnt/β-catenin信号通路。结果显示,上述四条白血病相关的信号通路能够被同时激活。Np9的表达与共激活β-catenin、ERK、AKT和Notch1可能相关。接着我们将正常成年人的外周血单个核细胞用上述同样地方法分析了Np9、 Numb、Cleaved Notchl、Grb2、Ras、ERK、pERK、c-myc、PLZF、pAKT和β-catenin等分子,发现在正常成年人的外周血单个核细胞不表达Np9,并且不能观察到白血病相关信号通路的激活。同样地,我们在高表达Np9蛋白的白血病病人的原代标本中也观察到了β-catenin、cleaved Notch1、ERK和c-myc的共激活。为了进一步明确是否是Np9的表达影响了上述关键信号分子的改变,我们建立了高表达Np9蛋白的Raji和低表达Np9蛋白的K562和Jurkat细胞系。利用Western blot技术对Np9蛋白和Numb/Notch、Ras/ERK1/2、c-myc/AKT和Wnt/β-catenin信号通路进行分析。结果发现,过表达Np9能显著上调β-catenin、 pERK、c-myc和Cleaved Notch1。而与此相应的是,Numb的表达水平降低(Numb和Cleaved Notchl互为抑制)。低表达Np9能显著下调了c-myc、pERK1、pAKT和Cleaved Notchl,而Numb的表达水平升高。通过GeneBank和相关软件对Np9蛋白的氨基酸序列特征进行分析和功能域预测。我们在Np9蛋白的氨基酸序列中鉴定到典型的Grb2SH3(N)-typical motif (PxxPxR)。这与我们在本部分的实验结果中观察到了Np9蛋白的表达能直接影响phospho-ERK的水平相一致。综上述三部分的实验结果,我们认为Np9蛋白在人白血病细胞系和白血病病人的原代细胞中普遍表达,而在正常人的血细胞中几乎不表达。Np9蛋白水平可能与CD34+白血病干／组细胞正相关。此外,Np9蛋白是白血病细胞生存和增殖的必须因素。该蛋白通过同时或者相继激活多条白血病相关的信号通路(Numb/Notch. Ras/ERK1/2、c-myc/AKT和Wnt/β-catenin)来调节白血病细胞甚至是白血病干／祖细胞的生存和增殖。