孤独症(autism)是一种广泛性脑发育障碍性疾病,主要表现为社会交往和认知障碍。通常婴儿期发病,特别是3岁左右表现最明显。大多数孤独症患儿有一个显著的头部发育特征,即2～3岁时头围大于同龄健康儿,而至青春期,头围可能又明显小于同龄儿童。孤独症的人群发病率是4/1000,男女发病比率约为4:1。孤独症的发病原因目前尚不清楚,大多数人认为是遗传因素和环境因素共同作用的结果。非遗传因素可能与出生前涉及脑发育的正常信号通路受到干扰有关,遗传因素则可能与这些信号通路的某些基因突变有关。Wnt是一类参与神经元发育,如神经干细胞自我更新及分化、轴突延伸和突触形成等的信号蛋白分子。脊椎动物中有超过16种Wnt蛋白分子,其共性是都含有一个在分泌之前被烷基化的半胱氨酸残基。在经典的Wnt信号通路中,Wnt蛋白与细胞表面的卷曲蛋白受体结合而激活下游的散乱蛋白(Dvl)。散乱蛋白的激活则能够抑制GSK-3β、Axin和APC等信号蛋白分子形成的复合体,进而通过去磷酸化过程激活β-catenin。活化的β-catenin随之进入细胞核内,与TCF/LEF转录因子结合、诱导相关基因转录。据报道,很多神经精神性疾病,如孤独症、精神分裂和抑郁症等,都可能与Wnt信号通路异常有关。动物实验表明,敲除了Wnt通路中Dvl-1基因的小鼠表现出类似孤独症的社会行为障碍,也强烈提示Wnt信号通路与孤独症的发病有关。Wnt通路中的β-catenin承担着将核外信号传递到核内的作用,在该通路中处于关键地位、发挥重要作用,因此β-catenin的表达水平直接影响着Wnt信号通路的整体生物学效应。位于Wnt信号通路β-catenin上游的GSK-3β是一个最主要的负性调节因子,参与对β-catenin功能的调节。鉴于β-catenin和GSK-3β在Wnt信号通路中作用重要,本文对其做了以下研究:Ⅰ:首先,在Wistar大鼠孕期第12.5d时,给予一次性腹腔注射丙戊酸钠,建立子代鼠孤独症动物模型。通过Western blot方法,检测了孤独症模型大鼠前额叶皮层、海马和小脑中Wnt信号通路蛋白分子β-catenin和GSK-3β在发育过程中的表达变化,并与正常对照组进行比较。结果显示:大鼠生后1周(w),前额叶皮层中β-catenin的表达量模型组比对照组高,差异有统计学意义,海马和小脑内模型组和对照组之间的差异没有统计学意义;至第2、3、4w和第90天(d)时,模型组β-catenin在上述各脑区中的表达均比对照组高,随年龄增长,差异趋大。出生后1w,GSK-3β在前额叶皮层和海马的表达,模型组比对照组低,差异有统计学意义,而在小脑区的表达,两组差异无统计学意义;出生后2w、3w、4w和90d时,模型组GSK-3β在上述各脑区的表达均比对照组低,且随年龄增长差异更为明显。这些结果造成的事实,必定是孤独症模型大鼠脑内Wnt信号通路的信号传导亢进,而亢进的结果可能正是导致孤独症脑内神经元发育异常的主要原因之一。由此提示:Wnt信号通路亢进在孤独症的发病中起重要作用。Ⅱ:为从形态学进一步证明前述结果,本文进而选择性地对部分脑区进行了免疫组织化学染色观察。同样用前述孕鼠腹腔注射丙戊酸钠的方法,获得子代VPA孤独症模型大鼠。对出生后1～4w和90d模型鼠小脑内的GSK-3β进行免疫组织化学染色,并与对照组进行对比。结果显示:GSK-3β主要在小脑的浦肯野细胞胞浆中表达。在出生后1w,模型大鼠的GSK-3β免疫阳性神经元与对照组相比没有明显变化,至第2和3w时,模型组的GSK-3β免疫阳性神经元个数减少,而在第4w和90d时,模型组的GSK-3β免疫阳性神经元的减少更为明显,且部分神经元染色较淡,说明GSK-3β在小脑内的表达明显减少。这种形态变化与上述Western blot的结果相符。由于GSK-3β是β-catenin的主要负性调节因子,能使β-catenin发生磷酸化,使其进入蛋白酶体被降解。如果GSK-3β水平降低,那么对β-catenin的降解就会减少,从而引起Wnt信号增强。另外,我们对出生后90d的模型大鼠前额叶皮层进行了Glogi染色,结果显示:模型鼠的前额叶皮层锥体神经元密度增加,突起紊乱,顶树突缩短。这些变化有可能导致皮层的体积增加、神经元之间形成错误连结、脑区间神经回路异常以及兴奋与抑制失衡的神经元功能障碍等。综上所述,我们的工作提示:孤独症患者脑内Wnt信号增强,使神经元发生形态学改变,如神经元增殖过快、数量增加,进而导致孤独症患者脑组织体积增加,头围增大。而且神经元形态和数量的变化可能削弱环境对脑发育的作用,导致神经元之间形成错误的联系,阻碍了脑区间正常的神经网络形成,最终引起孤独症患者表现出社会交往、情绪和语言等方面的异常。