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海洋蕴含着大量的微生物资源,其中深海热液区由于其特殊的环境,生物多样性极其丰富。高温碱性普鲁兰酶和高温碱性蛋白酶已被广泛应用于食品加工、洗涤剂工业等多个领域,在工业生产中具有重要的地位。本文介绍了Geobacillus kaustophilus MCCC 1A02570中的普鲁兰酶、Vibrio fluvialis MCCC 1A02761中的中温蛋白酶以及Caloranaerobacter sp.TR13中的高温蛋白酶基因的异源表达、表达策略的优化以及酶学性质分析过程,并对这两种酶在开发过程中遇到的问题进行分析和讨论。该论文主要包括以下内容:(1)普鲁兰酶PulA的表达及酶学性质的分析。从58株来源于深海热液区的嗜热菌中分离得到一株普鲁兰酶产生菌Geobacillus kaustophilus MCCC 1A02570。并在E.coli BL21(DE3)中对普鲁兰酶基因pul A进行了高效表达,并在经Ni Sepharose?FF纯化后得到纯度较高的蛋白。经鉴定,酶水解普鲁兰糖后生成唯一水解产物麦芽三糖,因此为I型普鲁兰酶。通过酶学性质研究发现其在65℃下最适p H为8.0,且具有较好的热稳定性。该酶能显著提高淀粉的糖化速率和糖化效率,通过与淀粉酶的联用,可使糖化速率提高31.03%,糖化效率提高37.58%,可应用于淀粉工业、酿造工业等领域。(2)蛋白酶VFP的鉴定、表达及酶学性质分析。通过硫酸铵沉淀以及DEAE法对一株蛋白酶高产菌株Vibrio fluvialis MCCC 1A02761中的蛋白酶进行纯化分离,并通过质谱分析进行鉴定。之后再参考相关序列设计引物从菌株2761基因组上扩增相关蛋白酶基因,并通过对蛋白表达策略的逐步优化,最终使蛋白酶VFP以包涵体的形式在大肠杆菌中表达,并在透析复性后正确折叠成天然构象,得到具有蛋白酶活力的酶液。该蛋白酶在30℃至70℃都具有较高的酶活力,可在p H 5.0~9.0的中性及弱碱性环境下保持较高的酶活力和较好的热稳定性,Co2+和Ca2+离子能提高该蛋白酶的酶活力,Cu2+、Zn2+和Ni2+则会抑制蛋白酶的活力。SDS、DTT、Triton X-100以及EDTA都会抑制蛋白酶的酶活力。在以casein作为反应底物时,蛋白酶的Km值为0.636 mg/m L,Vmax为101 U/m L。(3)蛋白酶Calolysin的异源表达及酶学性质分析。通过对一株严格厌氧的中温铁还原细菌Caloranaerobacter sp.TR13进行基因组测序,并对其中的ORF00803所编码的蛋白酶基因进行异源表达。由于蛋白酶对宿主菌的自身代谢的影响,其在大肠杆菌中的表达量较低。后续通过分泌型表达宿主枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB800N实现了蛋白的高效表达。该蛋白酶在高温及碱性条件下具有良好的酶活力和热稳定性,在p H 9.0时酶在70℃下的半衰期长达3.5 h。当以casein作为底物时米氏常数Km和最大反应速率Vmax分别为0.5022 mg/m L和254.9 U/m L,当以BSA作为底物时蛋白酶的米氏常数Km和最大反应速率Vmax分别为0.1188 mg/m L和101.2 U/m L。对人工多肽的水解测试发现Calolysin的最适底物为Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p NA。通过酶抑制剂分析发现PMSF以及EDTA能强烈抑制蛋白酶活力,说明其为丝氨酸金属蛋白酶。