【摘 要】
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以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组DNA为模板,温度梯度PCR法扩增、重叠PCR技术校正其中的移码突变获得甲酸脱氢酶(FDH)基因fdh；构建重组表达质粒pET28a-fdh,转化大
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以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组DNA为模板,温度梯度PCR法扩增、重叠PCR技术校正其中的移码突变获得甲酸脱氢酶(FDH)基因fdh；构建重组表达质粒pET28a-fdh,转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达,SDS-PAGE分析表明酿酒酵母甲酸脱氢酶(SceFDH)得到高效表达,表达量约占菌体可溶性总蛋白30%,分子量为43kDa；一步镍金属螯合亲和层析后SceFDH比活达7.69U/mg;SceFDH酶学性质分析显示该酶的米氏常数为KmNAD+=49μM, Kmformate=4.5mM,最适反应温度和pH分别为30℃和pH=7.5,有极高的温度耐受性,80℃保温30分钟,残留酶活仍有75%左右。针对SceFDH只对辅酶NAD+有高度专一性,而不能催化辅酶NADP+的再生问题,通过多种来源FDH的氨基酸序列比对,选择了三个可能决定辅酶专一性的氨基酸Asp 195, Tyr196和Gln197进行定点饱和突变；显色法筛选突变体库获得2个阳性克隆——突变体1(Asp195Ser/Tyr 196Pro/Gln197Asn)和突变体2(Asp195Gln/Tyr 196His/Gln197Asn);两个突变体的表达结果与原SceFDH相似(分子量43kDa,均约占菌体可溶性总蛋白30%)Ni-NTA柱一步亲和层析后对NADP+的比活分别为2.04mU/mg和2.1mU/mg。两突变体米氏常数(KmNADP+)分别为4.7mM和1.7mM,最适反应温度和pH与突变前SceFDH相同,仍为30℃和pH7.5,pH稳定性有所改进,但温度稳定性急剧下降。
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