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微生物在污染环境的生物修复方面具有重要作用,它们通过一系列酶来对环境污染物进行降解。因此,研究污染物降解过程中关键酶的作用机理,对于阐明微生物降解污染物的生物过程以及生物修复机制具有重要意义。对硝基苯酚(PNP)是一种重要的化工原料,也是多种农药降解的中间产物,进入环境的PNP会残留在土壤和水体中,对动植物和人类的健康造成严重危害。1,2,4-苯三酚1,2-双加氧酶(PnpC)和对硝基苯酚4-单加氧酶(PnpA)是甲基对硫磷降解菌Pseudomonas putida DLL-E4代谢硝基苯酚类污染物过程中的两个关键酶。PnpC作用于1,2,4-苯三酚的1,2位,使其开环形成马来酰乙酸。它的结构主体由6个较长α螺旋、7个β折叠及转角组成,存在2个结构域：N端α螺旋结构域(NTD)和C端催化域(CCD). NTD区域中存在与CCD距离较远的3个较长α螺旋,在儿荼酚双加氧酶家族中都存在这样的3个α螺旋,这三个螺旋是它们分子中两个亚基形成二聚体的连接部位,但由于距离活性中心较远,目前少有关于这些螺旋区与酶活力关系的报道。PnpA是FAD依赖性单加氧酶,它在NADH和FAD存在下,通过加氧作用使PNP脱硝基生成对苯醌。利用pET表达系统构建了从PnpC蛋白质序列N端开始,依次截短23、10及5个氨基酸的三个表达质粒,并在大肠杆菌E. coli BL21(DE3) pLysS中进行可溶性表达。并对其表达产物进行酶活力测定,发现截短23个氨基酸后不表现催化能力,说明第一个螺旋对其酶活力是必需的。截短5个氨基酸后仍旧存在催化活性,说明N端五个氨基酸对于PnpC的酶活力影响不大。而10个氨基酸的截短导致PnpC在大肠杆菌中表达效率极低。通过Ni-NTA亲和层析及透析对重组表达于E. coli BL21(DE3) pLysS中的PnpA进行纯化。酶活测定试验发现PnpA存在底物抑制现象,反应体系中高浓度的PNP、 NADH、FAD都对其酶活产生抑制作用。分别对PNP、NADH、FAD进行试验,发现PNP的抑制浓度是0.4mM, NADH的抑制浓度是0.8mM, FAD的抑制浓度是0.08mM。对酶活反应体系进行了优化,其最优反应体系是：0.3mM PNP+0.8mM NADH+0.1mM FAD+20mMTris-HCl。在加入PNP之前先将体系与酶在4℃结合40min,依次加入PNP,20℃反应20min,利用格里斯试剂法检测亚硝酸根,最终计算其反应速率。通过全基因组测序发现Pseudomonas putida DLL-E4中存在与pnp基因簇类似的另外一个基因簇pnp2,利用pET表达系统构建相应的表达质粒对该基因簇中推测为对苯二酚双加氧酶(PnpC1C2b)和对硝基苯酚单加氧酶(PnpAb)进行了表达,证实PnpC1C2b的功能是催化对苯二酚开环,同时通过检测该酶的反应动力学曲线发现该酶与pnp基因簇中的PnpC1C2具有同样的的瞬间催化特性。而表达的PnpAb不能够降解PNP.