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研究背景及目的:胰腺癌恶性程度高,预后差,早期诊断困难,只有很少部分患者可以进行手术治疗,大部分患者发现病情时已经失去手术机会,传统的放疗和化疗手段疗效不佳。所以,我们开始探索新的途径来医治胰腺癌。表皮生长因子受体(EGFR)在多种实质性上皮源性肿瘤中,如胰腺癌、乳腺癌和大肠癌等均有过度表达和异常活化,与肿瘤的有丝分裂、凋亡抑制、细胞迁移和转移、血管形成,以及对常规细胞毒性治疗的抵抗均密切相关。因此EGFR已成为肿瘤靶向治疗中一个重要的靶点和热点。本实验拟将抗EGFR基因治疗与新型载体重组腺相关病毒相结合,利用噬菌体抗体库获得人抗EGFR单链抗体可变区(SCFV)基因,构建能在体内长期表达抗EGFR抗体的重组腺相关病毒(rAAV)载体,以胰腺癌细胞株和裸鼠胰腺癌种植瘤为模型,探讨其治疗肿瘤的可行性和有关机理,为临床开展抗EGFR基因治疗提供科学依据。研究方法:1、将人抗EGFR单链抗体可变区(SCFV)基因插入腺相关病毒载体的酶切位点,构建能在体内长期表达抗EGFR抗体的重组腺相关病毒载体;2、通过Westernblot方法验证抗EGFR抗体在293细胞、人胰腺癌细胞株和裸鼠胰腺癌种植瘤模型肿瘤组织中的表达;3、体外实验:人胰腺癌细胞株实验,包括(1)用WST-8法观察抗EGFR抗体对人胰腺癌细胞株增殖的影响;(2)利用Annexin V-FITC/PI双染技术,流式细胞仪检测人胰腺癌细胞的凋亡情况;4、体内实验:裸鼠胰腺癌种植瘤模型实验,包括(1)肿瘤体积测定;(2)提取肿瘤组织总RNA,应用RT-PCR技术观察肿瘤VEGF转录水平的变化:(3)应用免疫组化技术,CD31染色肿瘤血管内皮细胞,显微镜下测定平均微血管密度(MVD)。结果:1、成功了构建携带抗EGFR抗体的重组腺相关病毒载体,并通过酶切和PCR方法进行鉴定;2、抗EGFR抗体在293细胞、6株人胰腺癌细胞株(Panc-1、SW1990、Aspe-1、Capan-1、PCT-3及MiaPaCa-2)和裸鼠种植瘤模型肿瘤组织中有明显表达;3、在增殖实验中,抗EGFR抗体能抑制ASPC-1胰腺癌细胞的增殖(抑制率15.1±3.5%,与载体对照组相比有显著差异,P＜0.05);4、在凋亡实验中,抗EGFR抗体能引起6株人胰腺癌细胞株的明显凋亡(Panc-1:9.1%vs.0.4%;SW1990:17.2%vs.0.8%;Aspc-1 50.9%vs.0.8%;Capan-1:19.2%vs.0.8%;PCT-3:10.2%vs.0.5%;MiaPaCa-2:28.6%vs.3.0%);5、在裸鼠胰腺癌种植瘤模型实验中,抗EGFR抗体在固定的观察时间内,能使肿瘤体积的增加量明显减少(1.38±0.83cm~3 vs.4.60±2.17cm~3,p＜0.05);抗EGFR抗体与健择联合治疗组也能使肿瘤体积的增加量明显减少(0.13±0.19cm~3 vs.4.60±2.17cm~3,p＜0.05);与健择联合使用能明显增强抗EGFR抗体的作用(0.13±0.19cm~3 vs.1.38±0.83cm~3,p＜0.05)。6、在裸鼠胰腺癌种植瘤模型实验中,抗EGFR抗体组与对照组相比,VEGF mRNA转录水平有下降趋势,但是没有达到显著差异(0.10±0.06 vs.0.35±0.24,p＞0.05);抗EGFR抗体与健择联合治疗组与对照组相比,能显著降低VEGFmRNA转录水平(0.08±0.05 vs.0.35±0.24,P＜0.05);抗EGFR抗体治疗组和抗EGFR抗体与健择联合治疗组相比没有显著差异(0.10±0.06 vs.0.08±0.05,p＞0.05):7、在裸鼠胰腺癌种植瘤模型实验中,抗EGFR抗体组与对照组相比,平均微血管密度显著降低(41.4±5.4 vs.58.2±6.1,p＜0.05);抗EGFR抗体与健择联合治疗组与对照组相比,能显著降低VEGF mRNA转录水平(26.8±4.5 vs.58.2±6.1,P＜0.05);与健择联合使用能明显增强抗EGFR抗体的作用(26.8±4.5 vs.41.4±5.4.P＜0.05)。结论:通过体外细胞实验和动物体内实验证明,本实验成功构建携带抗EGFR抗体基因的重组腺相关病毒,其表达的抗EGFR抗体蛋白对人胰腺癌细胞株和裸鼠胰腺癌种植瘤模型均有抑制作用。