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通过将SPIO标记的GFP转基因胎鼠NSCs移植入面神经损伤大鼠脑内,并利用MRI对移植的NSCs进行活体示踪,探讨了移植的NSCs的在脑内的迁移情况及用MRI对移植NSCs进行活体示踪的可行性。结果显示移植的NSCs可在脑内存活并向损伤侧面神经核区域迁移,MRI可以显示移植细胞的迁移。因此,本课题为面神经损伤后的修复提供了一种新的思路（中枢神经元的修复）和建立了一种活体检测方法（MRI活体示踪移植细胞）,为进一步深入研究奠定了良好的实验基础。详细摘要如下:实验一面神经损伤大鼠模型的建立目的动物实验是研究面神经疾病的基础,无论是研究面神经损伤后的病理生理变化、神经再生过程,还是研究面神经疾病的病因和治疗,都需要建立理想的动物模型。本实验旨在建立面神经高位损伤模型,为面神经损伤后脑内移植NSCs研究奠定模型基础。方法SD大鼠12只,随机分为术后1周和3周组,然后将右侧面神经主干在茎乳孔根部牵拉出约3 mm切断。按规定时间处死大鼠并取材、制备石蜡切片,行HE、TB和TUNEL染色,观察双侧面神经元的凋亡情况。结果健侧和术后1周组损伤侧面神经元均未见明显凋亡,术后3周组损伤侧见大量凋亡面神经元。结论采用将面神经主干在茎乳孔根部牵拉出约3 mm切断的方法建立的面神经高位损伤模型成功诱导了面神经元的凋亡,且重复性好,为进一步研究奠定了良好的模型基础。实验二GFP转基因胎鼠NSCs的分离、培养和鉴定目的建立GFP转基因胎鼠NSCs的分离、培养和鉴定的方法,为面神经损伤后脑内移植NSCs研究准备供体细胞。方法①分离GFP转基因胎鼠的海马组织,用吸管吹打机械方法制成单细胞悬液。采用含B27、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）的无血清培养基培养。②利用Nestin抗体对原代和传代细胞进行特异性鉴定。③用胎牛血清诱导分化后,荧光显微镜下观察分化细胞的形态和GFP表达情况。利用NeuN、GFAP和O4抗体分别对分化后的神经元、星形胶质细胞和少枝胶质细胞进行特异性鉴定。结果①从GFP转基因胎鼠海马组织分离的细胞以悬浮方式生长,可形成典型的神经球,能在体外传代培养和连续形成克隆,且原代和传代细胞GFP表达均呈阳性。②免疫细胞化学染色示原代和传代细胞均为Nestin阳性。③血清诱导分化后的细胞可分别表达神经元、星形胶质细胞和少枝胶质细胞特异性抗原NeuN、GFAP和O4,且分化后的细胞GFP表达呈阳性。结论从GFP转基因胎鼠海马组织成功分离培养出了NSCs。培养出的细胞Nestin阳性且具有增殖、自我更新能力及向神经元及神经胶质细胞分化的潜力,且均可稳定表达GFP,因此可作为NSCs脑内移植实验研究的供体细胞。实验三GFP转基因胎鼠NSCs的SPIo标记及体外磁共振成像目的探索用SPIO体外标记NSCs的可行性及1.5 T MR仪对磁标记干细胞的显示能力,为进一步利用MRI活体示踪移植于面神经损伤脑内的NSCs奠定基础。方法①将SPIO和PLL混悬制备SPIO-PLL复合物,加入无血清NSCs条件培养液,使其中铁的终浓度为25μg/ml,PLL的终浓度为0.75μg/ml,然后与NSCs在37℃、5%CO2培养箱中共同孵育48小时,以便对NSCs进行SPIO标记。②用倒置相差显微镜和荧光显微镜观察标记细胞的形态和GFP表达。③于标记后24小时和诱导分化后5天行普鲁士蓝染色观察细胞内铁颗粒。④于标记后2、4、6天行台盼蓝拒染试验观察细胞活性。⑤于标记后2、4、6、8天用MTT法检测标记细胞的增殖。⑥用流式细胞仪检测标记后2天细胞的凋亡和坏死及细胞周期并用TUNEL方法检测细胞凋亡。⑦用NeuN、GFAP和O4抗体分别对标记细胞分化后的神经元、星形胶质细胞和少枝胶质细胞进行特异性鉴定。⑧用1.5 T MR仪对不同数量级的标记细胞行体外MRI。结果①SPIO标记和未标记的NSCs在光镜下形态无明显差别,但标记细胞颜色呈棕黄色;荧光显微镜下两组细胞绿色荧光强弱无明显差别。②普鲁士蓝染色显示SPIO标记NSCs和分化后的细胞胞质内均见大量蓝色颗粒,而未标记NSCs和分化后的细胞胞质内未见蓝色颗粒。③SPIO标记NSCs 2、4、6天组和未标记NSCs的台盼蓝拒染率比较均无统计学差异。④SPIO标记NSCs 2、4、6、8天组利未标记NSCs的OD值比较均无统计学差异。⑤SPIO标记NSCs 2天和未标记NSCs的凋亡和坏死及细胞周期比较无统计学差异,TUNEL法亦未检测到细胞凋亡。⑥SPIO标记NSCs诱导分化后的细胞可分别表达神经元、星形胶质细胞和少枝胶质细胞特异性抗原NeuN、GFAP和O4。⑦GRE T2*WI中,1×106管和1×105管均可见明显低信号改变,1×104管、1×103管和琼脂糖管未见明显低信号改变;FSE T2WI中,1×106管可见明显低信号改变,余4管未见明显低信号改变;T1WI中,5管的信号未见有明显差别。结论①SPIO-PLL复合物可用于体外标记NSCs,应用SPIO-PLL复合物标记NSCs安全、有效。②在1.5 TMR仪上,SPIO标记NSCs可引起明显信号降低,且信号降低程度与标记细胞的数量和扫描序列有关,其中GRE T2*WI对信号改变最敏感。实验四面神经损伤大鼠脑内移植SPIO标记的GFP转基因胎鼠NSCs后的MRI示踪研究目的探讨大鼠面神经损伤后脑内移植SPIO标记的GFP转基因胎鼠的NSCs的迁移情况及用MRI对移植NSCs进行活体示踪的可行性。方法24只SD大鼠随机分为4组:A组为面神经切断后移植SPIO标记的GFP转基因胎鼠NSCs悬液;B组为面神经切断后移植未用SPIO标记的GFP转基因胎鼠NSCs悬液;C组为面神经切断后移植含SPIO的NSCs培养液;D组为正常大鼠移植SPIO标记的GFP转基因胎鼠NSCs悬液。造模后1周,行立体定向移植,注射点为前囟后方11.30 mm、背侧9.00 mm、正中线位置。分别于移植后第3天及第2、3、4周行MRI,并于第4周处死大鼠,取脑组织冰冻切片后用荧光显微镜和普鲁士蓝染色观察GFP和SPIO双标的NSCs的迁移,并将该结果与MRI相比较。结果①移植部位:MRI:A、C、D各组动物移植后第3天至第4周均呈类圆形低信号,且无明显改变,B组动物移植后第3天至第4周均无明显低信号;普鲁士蓝染色:A、C、D组对应于MRI低信号区呈蓝染,B组未见蓝染区域;GFP荧光检测:A、B、D组见多少不等的GFP阳性细胞,其中A、D组与普鲁士蓝蓝染区对应,C组未见GFP阳性细胞;②损伤侧面神经核区域（桥脑右份腹外侧区）:MRI:移植后第3天及第2周所有大鼠均未见低信号改变,移植后第3周及第4周A组动物中有3只（3/6）可见条形或点状低信号,A组动物中另外3只（3/6）及B、C、D组均未见低信号;普鲁士蓝染色:只有A组见多少不等的蓝染,与MRI低信号区相符,B、C、D组均未见蓝染;GFP荧光检测示:A、B组均见多少不等的GFP阳性细胞,其中A组与普鲁士蓝蓝染区对应,C、D组未见GFP阳性细胞。③健侧面神经核区域（桥脑左份腹外侧区）:MRI:4组均未见低信号改变;普鲁士蓝染色示:4组均未见蓝染;GFP荧光检测示:4组均未见GFP阳性细胞。④血管内:在移植部位附近和远离移植部位均见GFP阳性细胞位于血管内;⑤移植处与面神经核团区域之间:未见GFP阳性细胞或蓝色相连。结论SPIO和GFP双标记的NSCs移植入面神经损伤大鼠脑内后,可在脑内存活并向损伤侧面神经核区域迁移,利用MRI技术可以对移植后脑内的标记细胞进行初步活体示踪。