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目的:1.分析肺炎支原体肺炎(M PP)住院患儿的临床资料,以了解本地区MPP的临床特点,探讨年龄、MP-IgM抗体滴度与MPP临床表现的关系,为M P P的诊治提供可靠依据。2.构建pET28a(+)/mIL-17RC BL21(DE3)重组表达系统,及进行重组蛋白mIL-17RC表达、纯化及鉴定,为进一步研究IL-17A和IL-17RC的免疫功能提供基础。研究IL-17A、IL-17RC对肺上皮细胞分泌趋化因子的作用,以探讨M P感染诱发哮喘的机制,为进一步研究利用IL-17RC结合IL-17A以控制M P感染诱发的哮喘提供依据。 方法:1.选取2015年8月?2016年1月于我院儿科病房住院的肺炎支原体肺炎患儿为研究对象,回顾性分析患儿的一般资料、临床表现、实验室和影像学检查、肺功能、肺外并发症、治疗和转归情况。2.设计mIL-17RC胞外段引物,以小鼠cDNA为模板,PCR获得mIL-17RC DNA。目的基因连接T载体后,转化感受态细胞E.coli TOP10,经蓝白斑筛选得到阳性克隆。T克隆产物和pET28a(+)分别酶切后连接,然后转化感受态细胞E.coli DH5a,经PCR、酶切、测序验证后,将重组质粒pET28a(+)/mIL-17RC转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)。IPTG诱导表达重组蛋白mIL-17RC,经 SDS-PAGE电泳验证,主要以包涵体形式存在。采用Ni2+-NTA纯化、尿素梯度透析、超滤的方法进行目的蛋白的分离和纯化。所得蛋白以兔抗小鼠IL-17RC抗体为一抗,HRP标记的羊抗兔抗体为二抗,进行Western-blot鉴定,以检测mIL-17RC与其抗体结合的能力。采用生物素-亲和素ELISA方法,以检测IL-17RC与其配体IL-17A结合的能力。分别用IL-17A、IL-17A+IL-17RC、P B S刺激肺上皮细胞MLE-12,E L IS A法检测培养液上清中CXCL-1、CXCL-2、CXCL-5含量。 结果:1.本研究共收集病例249例,其中男108例,女141例,年龄8月?14岁。M P P患儿以学龄前期和学龄期儿童多见,分别占45.8%和36.5%。发热和咳嗽是MPP最主要的临床表现,发热以中高热为主,约1/2患儿出现喘息。大多数患儿白细胞计数和中性粒细胞百分比正常。右下肺是MPP最常累及的部位。约1/3患儿合并肺外并发症,消化系统最易累及。相比于婴幼儿,年长儿发热程度、C反应蛋白、血沉、MP-IgM抗体滴度和重症肺炎发生率均较高,喘息发生率较低。MP-IgM抗体滴度较高(1:640)的患儿,住院时间、发热时间和啰音持续时间均较长。所有患儿使用大环内酯类抗生素治疗,部分患儿联用其他抗生素和(或)激素治疗。所有患儿均治愈或好转出院。2.扩增获得mIL-17RC编码序列经测序鉴定与Genbank中数据一致,表明本研究成功构建了pET28a(+)/mIL-17RC重组质粒。mIL-17RC可在大肠杆菌中高效表达,纯化复性后的目的蛋白经Western-blot和生物素-亲和素E L IS A鉴定,证明可与其抗体和配体结合。三组培养液上清中CXCL-1、CXCL-5含量的差异均具有统计学意义,IL-17A组高于IL-17A+IL-17RC组和PBS组。三组间CXCL-2含量的差异无统计学意义。 结论:1.MPP患儿以学龄前期和学龄期儿童多见。发热和咳嗽是M P P最主要的临床表现。大多数患儿白细胞计数和中性粒细胞百分比正常。右下肺是MPP最常累及的部位。约1/3患儿合并肺外并发症。2.相比于婴幼儿,年长儿发热程度、C反应蛋白、血沉、MP-IgM抗体滴度和重症肺炎发生率均较高,喘息发生率较低。3. MP-IgM抗体滴度较高的患儿,住院时间、发热时间和啰音持续时间均较长。4.大环内酯类抗生素是治疗MPP的有效药物。大部分MPP患儿预后良好。5.本研究成功构建了 pET28a(+)/mIL-17RC重组质粒,且目的基因无突变。6.mIL-17RC可在大肠杆菌中高效表达,并可与其抗体和配体结合。7.IL-17A可刺激肺上皮细胞分泌CXCL-1、CXCL-5,所制备的IL-17RC可阻断此作用。8.MP感染可能通过诱导产生IL-17A,促进气道上皮细胞分泌CXCL-1、CXCL-5,进而诱导中性粒细胞募集,诱发哮喘的发生。