双生病毒是一大类在世界范围内严重危害植物及动物的单链环状DNA病毒。烟粉虱Bemisia tabaci属半翅目粉虱科,是一个包含至少36个隐存种的物种复合群。菜豆金黄花叶病毒属是双生病毒科中最大的一个属,已记录400余种,全部是由烟粉虱特异性传播的植物病毒。烟粉虱以持久循环型方式传播双生病毒。病毒需要克服烟粉虱体内的中肠侵染和扩散屏障、以及唾液腺侵染和逃逸屏障进行植物之间的传播,需要克服卵巢及卵的侵染屏障进行烟粉虱上下代之间的传播。病毒需要借助于自身结构蛋白与介体昆虫蛋白之间的互作来帮助自身高效地穿过这些屏障。然而,双生病毒穿过介体烟粉虱体内屏障的关键受体蛋白尚未明确。此外,双生病毒能否在介体烟粉虱体内复制也一直存在争议。本文针对这些重要问题开展研究,结果如下:1)双生病毒经卵传播的机制本实验室前期研究发现,MEAM 1烟粉虱可以经卵传播番茄黄曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYLCV),而且传播效率随着烟粉虱雌成虫日龄的增加而升高,原因是TYLCV进入烟粉虱卵巢的效率与卵巢的发育程度正相关。然而,中国番木瓜曲叶病毒(papaya leaf curl China virus,PaLCuCNV)则不能进入卵巢,因此也就不能由烟粉虱经卵传播。鉴于卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)在昆虫卵巢发育中的重要作用,我们推测Vg可能参与了 TYLCV进入卵巢的过程。这里,我们发现TYLCV的外壳蛋白(CP)可以与Vg互作,而PaLCuCNV的CP则不能。免疫荧光实验发现TYLCV通过与Vg相同的路径进入卵子中。当干扰Vg的表达时,TYLCV进入卵巢的量减少,经卵传播的效率也相应降低,说明TYLCV CP与Vg的结合可以帮助TYLCV进入烟粉虱卵巢。我们还发现,在没有病毒寄主植物存在的情况下,TYLCV能以经卵传播的方式在烟粉虱种群中至少存留两代,且后代成虫依然保持传播TYLCV的能力。2)TYLCV在烟粉虱体内复制的部位上面的结果表明,TYLCV可以由烟粉虱经卵传播至少两代,且后代成虫依然保持传播TYLCV的能力。这一现象暗示TYLCV可能在烟粉虱体内复制。定量检测带毒烟粉虱所产生的子一代(F1)成虫体内的病毒量发现,在Fl成虫羽化后的前11天内TYLCV的量逐渐增加,说明TYLCV在F1成虫体内确实发生了复制。荧光原位杂交和免疫荧光实验发现,只能在F1成虫的唾液腺中检测到TYLCV,中肠中则不能。检测长期持毒过程中烟粉虱不同组织内病毒量的变化情况发现,TYLCV只在唾液腺中积累,而PaLCuCNV则不会积累。进一步检测病毒互补链DNA的变化以及病毒基因的转录,结果同样表明TYLCV主要在唾液腺的中间区域复制,而PaLCuCNV则不能复制。这些结果表明,TYLCV可以在烟粉虱体内复制,而复制主要发生在唾液腺中部连接唾管的区域。3)TYLCV在烟粉虱体内复制的机制为了探究TYLCV在烟粉虱体内复制的机制,我们测定了 TYLCV侵染对MEAM 1烟粉虱唾液腺基因转录水平的影响。发现TYLCV侵染后,唾液腺中许多DNA合成相关基因的表达发生上调,例如增殖细胞核抗原(PCNA)和DNA聚合酶Δ。也观察到TYLCV的复制相关蛋白(Rep)可以与烟粉虱PCNA发生互作,进而促进病毒复制。而且,TYLCV的复制依赖于烟粉虱的DNA聚合酶δ。相反,PaLCuCNV则不会诱导烟粉虱的PCNA和DNA聚合酶δ的表达,PaLCuCNV的Rep也不能与PCNA互作。4)TYLCV穿过中肠肠壁的机制我们采用中肠特异性免疫共沉淀结合高效液相质谱分析的方法,鉴定到76个(包括Vg)特异性与TYLCV CP共沉淀的烟粉虱中肠蛋白。因为前面已发现,TYLCV CP可以与烟粉虱Vg发生互作,且该互作可以帮助TYLCV克服经卵传播的屏障,所以我们选取Vg进行后续的研究。首先通过多种手段验证了 Vg确实在烟粉虱中肠中有表达。之后通过免疫荧光实验发现,TYLCV与Vg在烟粉虱中肠细胞中存在共定位,而且TYLCV和Vg—起穿过烟粉虱中肠上皮细胞,说明TYLCV与Vg的互作可能在TYLCV穿过烟粉虱中肠屏障的过程中也发挥着重要作用。当使用RNAi干扰Vg的表达或使用Vg抗体阻断TYLCV与Vg的互作时,TYLCV穿过烟粉虱中肠细胞的效率均显著降低,说明TYLCV与Vg的互作能使TYLCV穿过烟粉虱中肠这一屏障。这些结果表明,Vg是TYLCV穿过烟粉虱中肠肠壁的介体蛋白,同时也表明中肠是昆虫体内除脂肪体以外另一个合成Vg蛋白的器官。综上所述,本研究发现了烟粉虱Vg在TYLCV穿过中肠肠壁和经卵传播的过程中发挥重要作用,并初步解析了其作用机制。同时,证明了TYLCV是可以在烟粉虱体内复制的,并找到了其复制的主要部位,阐明了复制的机制。这些发现不仅可以帮助我们理解TYLCV近年在全球迅速扩散危害的主要内在因子,对改进目前防控番茄曲叶病的技术体系、以及研发防控该病毒病的新方法提供了新的科学基础,而且对理解和探索病毒与媒介昆虫之间互作的复杂关系有重要参考价值。此外,本研究发现了昆虫体内除脂肪体以外另一个合成Vg蛋白的器官——中肠。