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赖氨酸是人体和动物体必需氨基酸之一,在饲料和医药行业中有广泛的应用。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是重要的赖氨酸生产菌。通过过去几十年的菌株诱变筛选及代谢工程改造,人们获得了大量的赖氨酸生产菌株。本实验室前期对18株不同赖氨酸产酸水平的谷氨酸棒杆菌进行了全基因组测序和比较基因组分析,并根据基因组亲缘关系进行了谱系划分,对不同谱系菌株的高产机制进行了预测。本研究在前期工作的基础上,对赖氨酸代谢途径中有突变位点的关键酶进行了活性测定、回复突变等分析,检测关键酶突变对菌株产赖氨酸的影响。通过对同属一个进化谱系的谷氨酸棒杆菌赖氨酸高产菌ZL5及低产菌A12中lysC基因编码的天冬氨酸激酶(aspartokinase,LysC)和hom编码的高丝氨酸脱氢酶(homoserine dehydrogenase,Hom)进行分析,发现ZL5菌株的LysC和Hom分别存在一个点突变LysC(G359D)和Hom(Q399*,399位谷氨酰胺突变为终止密码子)。LysC(G359D)在赖氨酸和苏氨酸浓度为10 mM时仍保留约80%的活性,而此条件下LysC-A12酶活力损失90%以上;对ZL5的LysC(G359D)基因回复突变后,赖氨酸产量下降16%,由此看出,LysC(G359D)能够显著解除赖氨酸和苏氨酸协同抑制,从而大幅提高菌株赖氨酸生产水平。对ZL5菌株的Hom(Q399*)编码基因进行回复突变后,赖氨酸产量下降了 88.57%,Hom为苏氨酸合成关键酶,实验结果说明苏氨酸途径弱化是ZL5菌株高产赖氨酸的重要原因之一。对赖氨酸高产菌D菌株中二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase,Dap A,K293E)编码基因dapA进行回复突变后,赖氨酸产量下降8.57%,DapA催化的反应是赖氨酸合成途径中的限速步骤之一,实验结果说明DapA(K293E)突变利于赖氨酸合成。对同属一个进化谱系的高产菌株C和低产菌株A14中asd基因编码的天冬氨酸半醛脱氢酶(aspartate-semialdehyde dehydrogenase,Asd)和ddh基因编码的二氨基庚二酸脱氢酶(meso-Diaminopimelate Dehydrogenase,Ddh)进行比对发现,C菌株中的这两个酶都存在点突变,分别为Asd(V183A)和Ddh(A175V)。对酶的比活力进行检测分析发现,Asd突变体的比活力是野生型的91%,Ddh突变体的比活力是野生型的1.25倍。对C菌株的asd和ddh基因分别进行回复突变后,菌株的产酸水平分别提高了 5.6%和12.0%。虽然这两个突变体酶活降低或提高情况不同,但是都对菌株产酸产生了不利影响,说明只有酶活适度才能促进产酸。本文通过实验证实了两个关键酶突变体LysC(G395D)和DapA(K293E)对于赖氨酸高产的重要作用;同时,进一步证实苏氨酸途径关键酶Hom的弱化能够大幅促进赖氨酸的合成。C菌株的asd和ddh基因突变可能是在进化过程中引入,说明不是高产菌株中的所有点突变都是有利的。本文的研究为进一步改造赖氨酸工业菌株提供了新的靶点和理论依据。