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吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinine, PQQ)是20世纪70年代末发现的一种新型氧化还原酶的辅酶,具有抗氧化、调节线粒体功能、参与细胞内信号转导等多种生理活性,目前已应用于医药领域和部分农业行业等。本实验室前期研究表明PQQ能够提高鸡体抗氧化能力、减轻蛋鸡肝脏损伤。PQQ.Na2是目前PQQ生产和应用中主要形式。脂肪肝出血综合征是产蛋鸡的一种常见病和多发病,严重威胁蛋鸡业健康发展。本论文旨在研究PQQ.Na2调控蛋鸡脂肪肝的效果及作用机理,包括动物饲养和细胞培养试验两部分。试验一：吡咯喹啉醌钠对脂肪肝蛋鸡生产性能、蛋品质、脂质代谢及线粒体功能的影响本试验旨在研究吡咯喹啉醌钠(PQQ.Na2)对试验性诱导的蛋鸡脂肪肝综合征的调控效果。选用29周龄海兰褐蛋鸡288只,随机分为4组：正常对照组,饲喂基础饲粮(代谢能11.03MJ/kg,粗蛋白16.2%)；病理模型组,饲喂高能低蛋白饲粮(代谢能12.75MJ/kg,粗蛋白13.0%)；在高能低蛋白饲粮中添加0.08或0.16mg/kg的PQQ.Na2。每组6个重复,每个重复12只鸡。试验持续4周。结果表明：1)高能低蛋白饲粮诱导蛋鸡发生脂肪肝,表现为肝细胞弥散性脂肪变性,肝脂率、血浆和肝脏中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)显著升高(P<0.05),血浆谷丙转氨酶(ALT)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性显著升高(P<0.05);2)饲粮添加PQQ.Na2可显著降低脂肪肝蛋鸡平均日采食量和料蛋比的升高(P<0.05),显著抑制脂肪肝蛋鸡的鸡蛋品质下降(P<0.05),抑制蛋白高度、哈氏单位和蛋黄颜色的降低(P<0.05),并显著抑制了肝脏和血浆中TG和TC及血浆中LDL-C含量、ALT和LDH活性的升高(P<0.05)；3)饲粮添加PQQ.Na2可显著抑制脂肪肝蛋鸡体内超氧化物歧化酶(SOD)活性降低和丙二醛(MDA)含量升高(P<0.05);4)饲粮添加PQQ.Na2可显著抑制脂肪肝蛋鸡肝脏内线粒体相对含量减少(P<0.05),抑制柠檬酸合成酶(CS)和细胞色素C氧化酶(CCO)活性降低(P<0.05)。可见,饲粮PQQ.Na2可改善蛋鸡肝脏线粒体功能,调节脂质代谢,预防高能低蛋白饲粮诱发的脂肪肝。本试验提示,饲粮中添加适量PQQ.Na2对预防蛋鸡脂肪肝综合征具有积极作用。试验二.吡咯喹啉醌钠对脂肪变性和氧化应激的蛋鸡原代肝细胞损伤的保护作用脂肪肝综合征是肝细胞脂肪变性基础上氧化应激引起的典型肝损伤。蛋鸡饲养试验表明,PQQ.Na2能降低蛋鸡脂肪肝的发生,减少氧化应激和线粒体损伤,但其具体作用机制尚不清楚。本试验通过蛋鸡原代肝细胞的脂肪变性模型和氧化应激模型,探讨PQQ.Na2在调控蛋鸡脂肪肝中的作用机制。试验首先研究了PQQ.Na2对肝细胞的毒性,选择促进肝细胞生长的适宜PQQ.Na2浓度,开展脂肪变性细胞模型和氧化应激细胞模型研究。通过用油酸(OA)和棕榈酸(PA)混合物处理蛋鸡肝细胞,选择适宜剂量和时间,成功构建肝细胞脂肪变性模型,研究PQQ.Na,对脂肪变性蛋鸡肝细胞保护作用；将肝细胞用PQQ.Na2预处理后,加入H202诱导,研究PQQ.Na2预防肝细胞发生氧化应激的作用。围绕肝细胞线粒体功能,系统研究PQQ.Na2对脂肪变性和氧化应激肝细胞线粒体数量及合成基因的调控作用,揭示了PQQ.Na2调控蛋鸡肝细胞脂肪变性和缓解氧化应激的线粒体作用机制。结果表明：1)PQQ.Na2浓度大于400mol/L时细胞存活率显著降低,具有明显的毒性作用；0～200nmol/L时,肝细胞与对照相比生长相当或略好,故将0～2001mol/L确定为PQQ.Na2用于肝细胞试验的适宜浓度。2)1mmol/L的OA和PA混合物处理蛋鸡肝细胞24h,油红O染色,与对照相比,细胞内有大量橘红色脂滴,TG含量显著升高(P<0.05),可用于构建蛋鸡肝细胞脂肪变性模型；PQQ.Na2与脂肪酸(OA和PA)混合物共同处理肝细胞,显著降低肝细胞内TG和MDA含量(P<0.05),降低肝细胞内ALT和谷草转氨酶(AST)活性(P<0.05),显著增加线粒体相对含量(P<0.05)。3)PQQ.Na2预处理能减少H2O2引起的蛋鸡原代肝细胞死亡,减少氧化应激过程中活性氧的生成、降低MDA含量、提高SOD活性(P<0.05),增加氧化应激肝细胞内线粒体相对含量(P<0.05)。4)在脂肪变性蛋鸡肝细胞中PQQ.Na2能显著提高核呼吸因子-1(NRF-1)和线粒体转录因子A (mtTFA)基因mRNA表达水平(P<0.05)；在氧化应激肝细胞中PQQ.Na2能提高过氧化物酶体增殖活化受体Y共激活因子-1α(PGC-1α)、NRF1、NRF-2和mtTFA基因的mRNA表达水平(P<0.05)。综上,在脂肪变性肝细胞中PQQ.Na2可通过减少细胞内氧化应激,激活线粒体合成修复路径、增加线粒体合成,维持线粒体功能稳定来减少肝细胞脂肪变性。总之,PQQ.Na2在动物饲养试验和细胞培养试验中均表现出调控肝细胞脂肪变性的良好潜力。饲粮中添加PQQ.Na2能预防产蛋鸡因采食高能低蛋白饲粮发生的脂肪肝,在脂肪变性和氧化应激肝细胞模型中添加PQQ.Na2能够通过减轻细胞内氧化应激,促进线粒体合成并维持其功能的方式提高细胞存活率,减少肝细胞脂肪变性或氧化应激损伤。本研究提示,作为一种能够调控蛋鸡脂肪肝征的营养素,PQQ.Na2在蛋鸡生产中具有广阔的应用前景,但对其作用机理尚需开展更加深入的研究。