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研究背景:细胞受辐射后,会产生大量的活性氧(ROS),过多的ROS能造成生物大分子的损伤,最终导致细胞凋亡。机体较长时间内接受一定剂量的辐射,可引起造血功能障碍等慢性放射性损伤。羟自由基是ROS中最具有危害性的自由基,在细胞凋亡中起着关键性的作用。本研究用X-射线照射U937细胞,对80种中草药清除U937细胞内羟自由基的能力进行筛选,其中筛选出熊果苷可能是有效的羟自由基清除剂。熊果苷(Arbutin)是一种氢醌苷类物质,主要用来治疗色素性疾病。然而,关于熊果苷的抗辐射作用至今没有报道。研究目的:本实验拟观察熊果苷对辐射导致人白血病细胞凋亡的防护作用,研究熊果苷的抗辐射作用是否与其保护细胞DNA、抑制细胞凋亡有关,并且进一步探究熊果苷发挥抗辐射作用时可能参与的信号通路及其分子机制。研究方法:将U937细胞为成4组:对照组、熊果苷组(浓度分别为50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、500μmol/L)、X-射线照射组(10Gy)、联合组(熊果苷+X-射线照射)。各组用Giemsa染色观察U937细胞核形态的变化;经AnnexinV-FITC/PI双染后,用流式细胞仪检测U937细胞的凋亡率;用分光光度计进行U937细胞DNA断裂的定量分析;使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测U937细胞的存活率;使用羟苯基荧光素(HPF)探针检测熊果苷清除U937细胞内ROS的能力;使用Tetramethylrhodamine methyl ester(TMRM)荧光探针检测U937细胞线粒体膜电位的变化;用Western blot方法检测U937细胞内凋亡相关蛋白的表达;用FLICE/Caspase-8色度蛋白酶测定试剂盒测量U937细胞内caspase-8的活性;经FITC标记抗-Fas单克隆抗体,用流式细胞仪检测Fas阳性的U937细胞百分率。统计分析:结果用均数±标准差表示。统计分析采用Student’s t检验,P<0.05具有统计学意义,所有实验至少重复3次。研究结果:我们确认熊果苷能够抑制电离辐射导致的细胞凋亡,并且存在浓度依赖性。熊果苷与X-射线照射联合处理能减少U937细胞内羟自由基的产生和抑制线粒体膜电位的下降;还能使细胞裂解物中的JNK和P38磷酸化水平下调以及抑制线粒体膜上Bax蛋白的活化。熊果苷同样还能抑制线粒体释放细胞色素C(Cyctochme C,Cyt-C)到细胞质中,进而抑制caspase-3的表达。为了验证JNK在X-射线照射导致U937细胞凋亡过程中的作用,U937细胞用JNK的抑制剂预先处理1h,结果显示,在照射组、熊果苷+照射组、JNK抑制剂+照射组、JNK抑制剂+熊果苷组中,U937细胞的早期凋亡率分别为17.30±3.47%、12.90±1.57%、12.67±1.78%、9.30±1.31%,每个联合组与照射组分别比较,均具有统计学意义(P<0.05)。此外,在对照组、熊果苷组、照射组、联合组中,Fas阳性的U937细胞百分率分别为3.15±0.07%、4.2±0.72%、8.91±1.0%、7.07±1.18%,联合组与照射组比较,具有统计学意义(P<0.05);U937细胞内凋亡相关蛋白激酶caspase-8的活性率分别为0.05±0.01%、0.07±0.01%、0.26±0.02%、0.17±0.13%,联合组与照射组比较,均具有统计学意义(P<0.05)。研究结论:熊果苷对U937细胞没有明显的细胞毒性作用,并且抗辐射效果显著,是一种潜在的抗辐射试剂;熊果苷能抑制辐射导致的U937细胞凋亡,其作用与保护细胞DNA,清除细胞内ROS有关;熊果苷能有效地清除ROS中的羟自由基,是有效的细胞内羟自由基清除剂;熊果苷是通过抑制Bax-线粒体介导的凋亡途径以及抑制JNK/P38 MAPK途径的激活来发挥抗辐射作用。