背景及目的慢性疼痛周期长、难以治愈,限制患者的日常活动和劳动并容易引起烦躁、抑郁等负面的情绪。患者往往在身体和精神两方面都承受着长期且繁重的负担,生活质量从而受到严重损害。据世界卫生组织报道,欧美约有35%的成年人,约12-15亿人正在承受着慢性疼痛带来的痛苦,并且,随着全球“老龄化”的到来,这个数字将会进一步增加。目前的治疗手段虽然种类繁多,例如物理手段(激光、红外线、电磁等)、镇痛药物(阿片类、抗炎类、镇静类等)和手术等,但是慢性疼痛状况没有得到很好的控制。其中重要的原因就是我们对于慢性疼痛发生、发展的机制还了解不够,治疗盲目凭经验而没有针对性,因此,系统地阐明慢性疼痛发生发展的机制并在此基础上研制新的镇痛手段和药物是目前基础研究工作者和临床医生面临的两大重要课题和任务。本课题正是着眼于这两大任务,首先在经典的神经病理性痛模型(CCI)上观察到阻断EphB受体具有良好的镇痛作用,并且通过更加接近临床实际的骨癌痛模型验证了阻断EphB受体的良好的镇痛效果；其次我们详细阐述了这其中的机制,即阻断EphB受体信号可以下调DRG和脊髓背角神经元的兴奋性并通过负性调节NMDAR磷酸化水平来下调突触传递效能来最终缓解慢性疼痛；接下来,我们还阐述了EphB受体信号通路在吗啡耐受和依赖过程中也具有与在慢性疼痛中相似的作用,为克服吗啡的副作用,扩大其临床应用提供了一条新的思路。第一部分：ephrinB-EphB受体信号在慢性疼痛中的作用及机制研究[目的]探讨ephrinB-EphB受体信号在慢性疼痛过程中的作用并阐述其机制。[方法]本论文主要关注神经病理性痛及相关的临床疾病,所以动物模型首先选择的是经典的神经损伤类的慢性坐骨神经结扎(CCI)模型。鞘内注射EphB受体的阻滞剂(EphB-Fc)以阻断脊髓背角的EphB受体信号,并通过辐射热法和Von Frey法检测各组的热痛敏(伤害性刺激性痛敏)和机械痛敏(非伤害性刺激性痛敏),随后通过统计分析观察阻断EphB信号通路对于CCI诱导的痛行为的影响。其中,依据给药的时间点和次数的不同又细分为若干组：1)在CCI诱导的痛敏的发展期(1-3天)和维持期(3天后)分别给予EphB-Fc,以观察阻断EphB受体信号在两个时期中是否有不同的作用效果；2)通过单次给药来分析药物作用持续的时间,而通过连续三次给药观察药物是否存在叠加效应或者耐受效应；其次,为了更加贴近临床治疗,我们选择了更加接近临床实际的乳腺癌细胞Walker256大鼠胫骨癌痛模型。依照同样的行为学测试方法,我们测试了连续三次给药对骨癌痛诱导的热痛敏和机械痛敏的影响；再次,我们利用Western Blot方法检测CCI和骨癌痛模型中脊髓组织和背根神经节组织中ephrinB和EphB的表达变化趋势,并利用免疫荧光方法进一步明确ephrinB和EphB在脊髓背角的分布及细胞定位；接着,以离体的DRG细胞膜片钳记录技术来研究EphB信号对CCI诱导的DRG神经元高兴奋性的影响,兴奋性的记录指标有动作电位的诱发阂值、诱发动作电位的的数量和发生自发性动作电位的神经元的数量(%)；以在体细胞外记录脊髓单个神经元技术研究EphB信号对CCI损伤诱导的脊髓广动力域(WDR)神经元高兴奋性的影响：通过在外周(足部)施加刷(轻)、夹持(中)和钳夹(重)三种不同性质(通过测量每平方毫米的力来定量)的刺激,观察所记录WDR神经元的动作电位发放的数量来分析脊髓神经元的兴奋性；以在体诱导C类纤维与脊髓背角神经元之间的LTP技术研究抑制EphB受体信号对LTP发生的影响,以反映EphB受体信号在突触可塑性中的作用；最后,以行为学测试(给予NMDAR特异性的抑制剂MK-801)和Western Blot等综合方法,对EphB信号对NMDAR磷酸化的调控进行了研究。[结果]鞘内注射EphB受体信号的阻断剂(EphB-Fc)能够预防性地(痛敏发展期给药)和治疗性地(痛敏维持期给药)阻滞神经损伤(CCI)诱发的热痛敏和机械痛敏；预防性单次给药可以推迟痛敏形成达2天,预防性连续三次给药则完全抑制了痛敏的形成；而治疗性给药,单次给药药物效果可以维持24小时,连续三次给药,药效在结束给药后24小时后消失,且药物无叠加和耐受效应；在骨癌痛模型上,因为骨癌痛形成的时间在术后第七天,所以预防性给予EphB-Fc的时间选择在术后第3、4、5连续三天进行,治疗性给药选择在术后第7、8、9三天进行(不同于CCI),同样观察到了预防性给药和治疗性给药都有效地抑制了热痛敏和机械痛敏。在Naive大鼠,鞘内注射EphB受体信号激动剂(ephrinB-Fc),单次注射和连续三次注射都可以引起一定程度的热痛敏,并且Western Blot结果显示磷酸化的EphB表达上调,表明ephrinB-Fc激活了EphB受体信号并且EphB受体信号确实参与疼痛的发生。以上实验结果,表明EphB受体信号参与神经病理性痛和骨癌痛的发生和发展过程,抑制EphB受体信号可以缓解慢性疼痛的发生。接下来,我们通过相关实验说明EphB受体信号参与慢性疼痛的机制。CCI和骨癌痛模型中,Western Blot对ephrinB和EphB蛋白表达的研究显示在背根神经节(DRG)和脊髓,ephrinB和EphB受体随疼痛的发展过程而表达增加,并与痛敏形成的时程保持一致,提示蛋白表达和痛敏之间存在相关性；免疫荧光定性染色显示ephrinB和EphB在DRG和脊髓背角浅层表达,而免疫荧光双标定位显示:ephrinB和EphB具有相似的定位,在脊髓则位于神经元和星形胶质细胞上,而在小胶质细胞上无或少量表达。另外,ephrinB还表达在CGRP阳性的纤维末梢上CCI造成的神经损伤可以诱导DRG神经元和脊髓广动力域(WDR)神经元的高兴奋性,在DRG表现为动作电位阂值下降、诱发性放电频率增加和自发性放电活动增加；在脊髓则表现为外周刺激诱导的WDR放电频率增加。EphB-Fc可以阻滞CCI诱导的DRG和脊髓背角WDR神经元的高兴奋性。另外,C类纤维与脊髓背角神经元之间的LTP反映了发生在C类纤维与脊髓背角突触上的突触可塑性,EphB-Fc可以预防性地阻滞C类纤维与脊髓背角神经元之间的LTP的产生,表明其参与调节慢性疼痛过程中发生在脊髓的突触敏化。鞘内注射EphB受体信号的激动剂(ephrinB-Fc)能够在Naive动物产生热痛敏并诱导脊髓背角EphBl受体及NMDAR相关分子通路磷酸化程度增加,而且这种情形下的热痛敏和EphBl及NMDAR相关信号分子磷酸化程度的增加可以被NDMAR特异性的抑制剂MK-801所阻滞。同样,在TCI模型中,EphB-Fc可以抑制TCI过程中活化的NMDAR相关的信号通路(NR1、NR2B、src、ERK、CaMKⅡ和CREB)。以上表明EphB受体信号通路参与NMDAR的调节。以上对EphB受体信号通路参与慢性疼痛的机制研究表明,EphB参与调节DRG和脊髓背角神经元的兴奋性,并通过调节NMDAR磷酸化过程参与外周神经与脊髓神经元之间突触可塑性。这是EphB受体信号调节慢性疼痛的机制。第二部分：ephrinB-EphB受体信号在吗啡耐受和戒断中的作用[目的]阿片类药物是目前临床上最有效的治疗难治性疼痛的药物,但其易依赖和易耐受的缺点限制了其在临床的广泛应用。吗啡耐受和依赖的机制研究表明,其与慢性疼痛有着极其相似的机制,都与谷氨酸受体介导的中枢敏化有关。另外,单独应用EphB信号的阻滞剂来治疗疼痛,可能会产生副作用,为了克服这个潜在的缺点,我们前瞻性地设想用联合吗啡的方法来治疗难治性疼痛,故此,我们在探讨了ephrinB和EphB在慢性疼痛中的作用之后,探讨ephrinB-EphB在吗啡耐受和吗啡戒断过程中的作用。[方法]为了探讨EphB受体信号对吗啡耐受过程的影响,我们首先在急、慢性吗啡耐受模型上预防性(在急性模型是给予吗啡前30分钟；在慢性模型是每次给予吗啡前30分钟)鞘内给予EphB受体的抑制剂(EphB-Fc),观察其对模型的行为学的影响,指标为最大镇痛效应百分率(%MPE),并以Western Blot技术观察了吗啡耐受过程中EphB受体信号的活化情况,以pEphB为指标；随后我们还在骨癌痛模型上测试了联合应用吗啡和EphB-Fc(与吗啡同时给予)对吗啡镇痛效果的影响,用以验证在急、慢性吗啡耐受模型中所得到的结果,测试方法是热痛敏检测。吗啡戒断部分,首先是在纳洛酮诱导的吗啡戒断模型上,预防性(分两种,一种是随吗啡一起注射,共7次；另一种是加倍剂量单次注射,在最后一次注射吗啡后5分钟时注射)鞘内注射EphB1-Fc后,观察后退走(backwalking)、咀嚼(chewing)、腹泻(diarrhea)、跳跃(jumps)、爪颤(paw tremor)、上睑下垂(ptosis)、打颤(tremor)、湿狗抖(wetdog shakes)和体重减轻(weight loss)等九项单独指标和由单独指标计算得来的综合评分；此外,还利用western blot技术检测了吗啡戒断过程中EphBl受体的表达及活化情况,表明上述过程中确有EphB受体信号的参与；紧接着,我们用免疫荧光定量观察了鞘内给予EphB1-Fc对脊髓c-fos表达和CGRP的影响,以辅助证明行为学的表现；最后为了说明EphB1-Fc参与吗啡耐受的机制是否通过调节NMDAR,我们用Western Blot技术检测了给予EphBl-Fc前后脊髓pNR2B、PERK和pCREB的变化。[结果]单针EphB-Fc能够在急、慢性吗啡耐受模型中预防性地增加吗啡的最大镇痛效应百分率(%MPE)且在吗啡急慢性模型中均检测到了EphB受体信号通路的活化,表明EphB受体信号通路确实参与吗啡耐受的形成；并且EphB-Fc可以在骨癌痛模型上阻滞吗啡耐受的形成；预防性给予EphB-Fc能够缓解吗啡戒断的行为学表现；吗啡应用和戒断成中c-fos表达增加,预防性给予EphB-Fc下调c-fos的表达,而CGRP的表达在吗啡应用过程中表达上调,预防性给予EphB-Fc下调CGRP的表达；吗啡戒断会使脊髓背角CGRP大量释放(表达下调),预防性给予EphB-Fc缓解了CGRP表达的下调。预防性给予EphB-Fc下调了吗啡应用和戒断过程中升高的NMDAR相关信号分子的磷酸化水平综合以上实验和结果我们得到了我们的结论：[结论]1. EphB受体信号可以通过调节DRG和脊髓神经元兴奋性以及NMDAR相关的突触可塑性参与慢性疼痛的发生和发展；抑制EphBl可以缓解慢性疼痛。2. EphB受体信号参与吗啡耐受和戒断过程；抑制EphBl可以减轻吗啡耐受和戒断,有利于辅助吗啡镇痛和缓解吗啡依赖,扩展吗啡的临床应用。