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丁型冠状病毒（Deltacoronavirus）在2011年划分为第四种冠状病毒属。猪丁型冠状病毒(PDCoV)是猪肠道疾病病原，能感染各年龄段的猪群，引起与猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎相似的腹泻、呕吐和脱水等症状。 自2011年PDCoV在香港被首次报道以来，美国，韩国，泰国以及中国内地均相继有报道，PDCoV的大范围爆发给各地区养殖业造成了巨大损失，给公共卫生安全埋下隐患。 本研究用昆虫细胞表达的PDCoV S1蛋白为包被抗原建立了间接酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测方法，检测了来自浙江、河南、黑龙江等7个省份地区的腹泻猪临床血清样品，调查了PDCoV的感染率;又采用原核系统成功表达PDCoV NS6蛋白，并制备抗NS6蛋白多克隆抗体，并利用该多克隆抗体检测PDCoV感染体外培养细胞时NS6蛋白的表达。 1、PDCoV-S1蛋白间接ELISA方法的建立与应用 本实验通过PCR扩增猪丁型冠状病毒(PDCoV)湖南株S1基因，与pFast-bac质粒相连构建重组质粒，转化DH10Bac感受态细胞得到重组质粒Bacmid-S1。重组质粒Bacmid-S1转染sf9昆虫细胞后，产生重组杆状病毒。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹实验(Western blot，WB)验证成功获得分泌性S1蛋白。利用Ni-NAT亲和层析方法，得到纯化的S1蛋白。用该蛋白建立间接ELISA检测方法，检测2015～2016年间收集的来自江苏、湖南、江西、河南、浙江、黑龙江和山东7个省份的609份具有腹泻症状的猪血清样品，结果显示，抗PDCoV S1抗体检出率为44.17％(269/609)。 2、PDCoV NS6蛋白的多克隆抗体制备 本实验通过PCR方法扩增猪丁型冠状病毒湖南株NS6基因，将其克隆至pET28a载体上构建重组质粒pET28a-PDCoV-NS6。将该重组质粒转化至表达感受态BL21细胞，进行原核表达，获得以包涵体形式表达的NS6蛋白，通过Ni-NTA亲和纯化柱，采用咪唑结合法pH梯度洗脱纯化NS6蛋白。以纯化的NS6蛋白作为免疫抗原，对新西兰白兔进行免疫，免疫四次后，ELISA检测兔血清抗体效价为1∶6400;将获得的抗NS6蛋白的多克隆抗体即含抗NS6蛋白抗体的兔血清，应用间接免疫荧光实验(indirect immunoinfluscent assay，IFA)和蛋白免疫印迹实验(Western blot，WB)进行检测验证。