小麦(Triticum aestivum L.)是全世界重要的粮食作物之一,其产量和质量的输出对全球粮食安全有着举足轻重的影响。半胱氨酸蛋白酶(Cysteine protease,CP)是一类功能强大的蛋白,不但参与植物的许多生理活动,而且在植物遭受胁迫时也起到重要作用,因此,对半胱氨酸蛋白酶的研究能够为培育出抗逆的高产优质小麦的选育提供一定的理论依据和实际意义。目前拟南芥中半胱氨酸蛋白酶的研究比较丰富,玉米、水稻和大麦等其它植物中的研究也比较多,相比而言,其在小麦中的研究还不够深入,因此,本研究工作能够为半胱氨酸蛋白酶在小麦中的作用提供一些参考。实验以普通小麦品种“中国春”(Chinese Spring,CS)和抗旱小麦品种“西农538”为材料,克隆TaCP3基因及其启动子序列,并且进行了序列的比对和生物信息分析;SDS-PAGE检测原核表达的TaCP3蛋白,并用Western blot进行鉴定;对特定苗期的小麦幼叶模拟干旱、高温、低温、高盐和旱热五种非生物胁迫,用荧光定量PCR对各胁迫下的、不同时间点的取样叶片中TaCP3基因的表达量进行分析;用拟南芥做功能验证,进一步将TaCP3在拟南芥中过表达,对其功能进行分析,观察其生长状态。试验结果如下:1.在两个品种中分别克隆得到TaCP3-3A、TaCP3-3B、TaCP3-3D基因,及“西农538”中三条染色体和中国春中3B染色体上的启动子序列。TaCP3-3A、TaCP3-3B、TaCP3-3D基因序列在两个品种中的差异不大,且均只含有一个开放阅读框,分别编码377、374、377个氨基酸组成的蛋白质,含有CP中木瓜类蛋白酶的典型结构域,也含有信号肽,说明其是分泌蛋白的可能性很大。以TaCP3-3B为目的基因进行后续分析和试验,进化树分析其属于木瓜类蛋白酶中的CEP1类蛋白酶(亚家族2)。启动子分析显示,光响应元件所占比例比较高,还有与干旱响应相关的MBS。2.原核表达的SDS-PAGE电泳结果和Western blot结果,证明TaCP3基因可以编码一个分子量为40 kD左右的蛋白质,与预测结果相一致。3.分析qRT-PCR的数据结果显示,E-64(CP特异性抑制剂)能够有效的抑制TaCP3基因的表达;在模拟上述五种非生物胁迫时,TaCP3均随着胁迫的发生而有表达量的差异;其中,TaCP3表达量在干旱胁迫下差异变化最明显,在高温、低温、高盐和旱热胁迫下也表现出不同程度的“下降-上升-下降”的一种变化规律。4.拟南芥的遗传转化结果显示,筛选到了含有转TaCP3基因的种子,成功的将TaCP3转入到了野生拟南芥中,干旱胁迫下通过对转基因植株和野生型植株的表型对比,可以确定TaCP3能够响应干旱胁迫。综上,可以确定克隆出的TaCP3基因就是半胱氨酸蛋白酶家族基因,且是木瓜类蛋白酶中的CEP1类蛋白酶基因;确定其可以在干旱胁迫中起作用,同时初步推测其能够响应高温、低温、高盐和旱热胁迫,极有可能参与到了相应的抗性活动中。