论文部分内容阅读
研究目的： 肠缺血再灌注(Ischemia reperfusion，I/R)损伤是临床多种重症疾病的常见病理生理学过程。研究表明雌激素对小肠缺血再灌注损伤有保护作用，但是目前为止，雌激素发挥作用的受体及受体后机制不清。我们在本课题中设计研究明确介导雌激素保护小肠缺血再灌注损伤的受体类型，并进一步明确受体特异性激活发挥保护作用的机制，以期为小肠缺血再灌注损伤精准治疗靶点的发现提供理论和实验依据。 第一部分 研究方法： 健康雄性成年C57BL/6小鼠，夹闭肠系膜上动脉缺血45分钟(min)后，分别在再灌注2小时(h)、4h、24h和72h后分离空肠，苏木素伊红(HE)染色观察再灌注不同时间点空肠肠黏膜损伤变化;根据实验结果选择再灌注时间点，建立实验所需的小肠缺血再灌注损伤模型，观察缺血期（缺血30min时）急性应用雌激素对小肠I/R诱导的空肠黏膜损伤及黏膜屏障破坏的影响;进一步分别观察选择性雌激素核受体阻断剂ICI182，780和选择性GPER阻断剂G15预处理对雌激素保护小肠I/R损伤作用的影响，明确介导雌激素保护小肠I/R损伤的受体类型。 研究结果： 1.小肠I/R损伤模型中，缺血再灌注引起显著的空肠黏膜损伤:绒毛顶端破损，绒毛顶端上皮下间隙增大，绒毛两侧上皮层与固有层分离，伴中性粒细胞浸润及毛细血管淤血。与假手术(Sham)组相比，小肠缺血再灌注2h和4h时，空肠黏膜严重受损，肠黏膜损伤评分(Chiu score)明显升高(n=4，p＜0.05， vsSham组);再灌注24h和72h时，空肠黏膜受损逐步恢复，肠黏膜损伤评分虽然高于假手术组，但未见统计学意义。 2.缺血期应用雌激素—17β-雌二醇(E2)，HE染色显示其对再灌注2h引起的空肠黏膜损伤有保护作用，但是，肠黏膜损伤评分与单纯缺血再灌注(I/Rvehicle)组无显著性差异;缺血期E2处理对再灌注4h诱导的空肠黏膜损伤有明显保护作用，肠黏膜损伤评分显著下降（n=4，p＜0.05， vs I/R vehicle组）。据此，在以后的实验中均以缺血45min再灌注4h建立I/R损伤模型进行实验。 3.选择性雌激素核受体阻断剂ICI182，780预处理，不影响E2对小肠I/R损伤模型空肠黏膜损伤的保护作用;相反，选择性GPER阻断剂G15预处理，完全阻断了E2对小肠I/R损伤模型中空肠黏膜损伤的保护作用，与缺血期E2处理(I/R+E2)组相比，空肠黏膜Chiu score明显升高（n=4，p＜0.05，vs I/R+E2组）。 4.小肠I/R损伤模型中，空肠紧密连接蛋白ZO-1在肠上皮顶端侧的线性表达的连续性中断或缺失;缺血期应用E2显著改善I/R损伤引起的空肠上皮ZO-1表达分布异常，该作用可被G15阻断。相反，ICI182，780预处理未影响E2对I/R损伤模型ZO-1表达的影响。 5.小肠I/R损伤模型中，空肠紧密连接蛋白Occludin在肠上皮细胞-细胞连接间表达的连续性和规整性丧失，分布紊乱;缺血期应用E2明显改善I/R引起的空肠上皮Occludin分布紊乱，该作用被G15阻断，而不受ICI182，780影响。 第二部分 研究方法： 健康雄性成年C57BL/6小鼠，夹闭肠系膜上动脉缺血45min，再灌注4h建立小肠缺血再灌注损伤动物模型，实验分为假手术（Sham）组、缺血再灌注损伤（I/R vehicle）组、缺血再灌注损伤并选择性GPER激动剂G-1处理（I/R+G-1）组。利用HE染色、透射电子显微镜观察、髓过氧化物酶(MPO)活力测定、空肠紧密连接蛋白检测及肠黏膜通透性检测等方法观察GPER选择性激活对小肠I/R损伤的保护作用。利用Western blot、RT-PCR及免疫荧光技术明确GPER在空肠的表达及定位。HE染色和免疫组织化学方法检测G-1处理对小肠I/R损伤模型中空肠隐窝干细胞增殖能力的影响;免疫组织化学、免疫荧光及Western blot方法检测GPER选择性激活对小肠I/R损伤模型iNOS表达的影响和iNOS表达对小肠I/R损伤模型空肠隐窝干细胞增殖的影响;RT-PCR和Western blot方法检测GPER选择性激活对小肠I/R损伤模型内质网应激相关蛋白GRP78和CHOP表达的影响。 研究结果： 1.缺血期（缺血30min时）应用GPER选择性激动剂G-1，显著改善I/R诱导的空肠黏膜损伤（n=6，p＜0.05， vs I/R vehicle组）。透射电子显微镜观察显示，小肠I/R后空肠黏膜上皮细胞间界限模糊不清，胞质内有大量空泡样改变，细胞核内出现异染色质边集现象;GPER选择性激活明显改善这一现象。 2.小肠I/R损伤模型中，空肠组织MPO活力明显增加（n=5，p＜0.05，vs Sham组）;G-1处理显著抑制I/R诱导的MPO活力增加(n=5，p＜0.05，vs I/R vehicle组)。 3.小肠I/R损伤模型中，空肠黏膜紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达和分布受损，肠黏膜通透性增加;G-1处理显著改善I/R引起的空肠黏膜屏障破坏。 4.空肠上皮、绒毛间质以及固有层有GPER阳性表达，空肠隐窝部位GPER呈现明显优势表达，LGR5+干细胞表达GPER。 5.小肠I/R损伤模型中，空肠隐窝干细胞增殖和上皮再生修复能力明显下降;G-1处理显著改善I/R引起的空肠隐窝干细胞增殖和上皮再生修复能力下调。 6.小肠I/R损伤模型中，空肠隐窝iNOS表达显著上调;G-1处理显著抑制I/R引起的iNOS表达升高;缺血期（缺血期30min）iNOS选择性抑制剂1400w处理改善I/R引起的空肠隐窝干细胞增殖和上皮再生修复能力下调，对肠黏膜损伤发挥保护作用。 7.缺血期G-1处理明显下调I/R诱导的空肠GRP78和CHOP表达升高，抑制I/R引起的内质网应激损伤。 研究结论： 小肠缺血再灌注损伤模型中，再灌注2h和4h时，空肠黏膜明显受损，至再灌注24h和72h时，空肠黏膜受损逐步恢复。雌激素通过激活雌激素膜受体GPER对小肠I/R损伤发挥保护作用。 GPER在空肠上皮、绒毛间质以及固有层表达，且空肠隐窝部位GPER呈现明显优势表达，LGR5+干细胞表达GPER。GPER激活通过抑制小肠I/R引起的炎性反应、空肠黏膜损伤和黏膜屏障破坏，改善肠黏膜通透性，对小肠I/R损伤发挥保护作用。GPER激活对小肠I/R损伤的保护作用，与抑制空肠隐窝细胞iNOS表达和内质网应激、保护空肠干细胞增殖能力以及促进空肠上皮再生修复有关。