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NDRG4(N-Myc downstream-regulated gene4)作为分析芯片数据(GDS586和GDS4924)时发现的一个表达差异基因,其在骨骼肌成肌分化过程中随着分化表达显著增加,在骨骼肌损伤再生过程中表达也显著增加,NDRG4在肌肉发育过程中可能发挥着重要作用,但它在骨骼肌发育中的功能未见报道。基于此,本研究探讨了NDRG4在肌细胞分化过程中的功能及其调控机制,并分析了该基因内SNP与猪生长育肥性状的关系,主要研究结果如下: 1.通过多序列比对结果,发现NDRG4蛋白在不同物种间具有很高的保守性,氨基酸序列相似性达87%以上,并且具有多段保守的氨基酸序列区域。在C2C12细胞和猪骨骼肌卫星细胞中检测发现NDRG4在成肌分化过程中分化期表达量显著高于细胞增殖期;在利用心脏毒素构建小鼠骨骼肌损伤再生模型中发现NDRG4在未损伤的小鼠后肢肌肉中表达量较低,损伤后2-5天NDRG4的表达量迅速增加。 2.通过构建NDRG4的超表达载体和RNA干涉片段,RTCAxCELLigence细胞增殖检测系统和流式细胞仪检测发现NDRG4不影响C2C12细胞增殖;Western blotting和细胞免疫荧光技术的结果表明,NDRG4能促进MyoD、MyoG和MyHC的表达,从而促进成肌分化。 3.免疫共沉淀和亚细胞共定位实验证明了NDRG4通过与pAkt竞争性结合CTMP蛋白,从而激活Akt/CREB通路;pcDNA3.1-NDRG4和CREB干涉片段或CREB磷酸化抑制剂(H89)的共处理实验证明了NDRG4通过CREB蛋白调控成肌分化,并且磷酸化的CREB(pCREB)在促进成肌分化中发挥主要作用;转录因子结合位点分析和ChIP实验证明了NDRG4通过提高pCREB在MyoD和MyoG启动子的结合活性来促进成肌分化。因此,NDRG4通过Akt/CREB通路促进骨骼肌细胞成肌分化。 4.通过PCR技术扫描猪NDRG4基因前3个外显子、前3个内含子和第20个外显子序列,鉴定出4个潜在的SNP位点。其中,rs342827092位点发生A→G转换突变,我们建立了该位点的Hinfl-RFLP分型方法。在大白猪和杜洛克猪群体中进行了标记与生长性状的关联分析,发现该SNP与杜洛克猪的100Kg体重日龄存在显著的关联性,AA基因型个体达100Kg体重日龄低于AG和GG型个体,且AA基因型和GG基因型个体间差异显著(P<0.05)。利用Sequenom SNP分型技术检测rs322396417、rs81499361和rs325739056三个位点的基因多态性,并分析基因多态性和性状之间的关联性。rs322396417位点多态性与法系大白猪的左右乳头数存在显著关联。CG型个体的左乳头数显著多于GG型个体,CC型个体的右乳头数显著多于GG型个体。rs81499361位点多态性对法系大白猪相关性状均没有显著影响。rs325739056位点多态性与法系大白猪的背膘厚存在极显著相关。AG型个体的背膘厚极显著大于GG型个体。 综上所述,本研究结果阐明了NDR G4对促进骨骼肌细胞C2C12分化的分子机制及NDRG4基因多态性与猪生长与繁殖性状间的关联,为NDRG4基因在猪育种中的应用奠定了理论基础。