目的:本研究以射干药材抗炎、止咳作用的药效物质基础研究为前提,针对射干药效物质种类多、对照品不易获得等原因造成的药材提取物及制剂质量控制难题,拟采用中国药典黄连项下的思路,开展抗炎、止咳药效成分的定性、定量分析研究,为射干提取物及制剂的质量评价、临床应用提供科学依据。材料与方法:1.总黄酮质量评价研究建立射干提取物及制剂的总黄酮测定方法,比较以6种药效物质基础成分作为对照品对总黄酮含量测定的影响:1.1.通过进行对照品及供试品溶液波长扫描,选择测定波长。1.2.建立供试品总黄酮含量分析方法,以野鸢尾黄素为对照品,开展线性、稳定性、精密度、回收率等方法学验证项。1.3.使用鸢尾黄素、鸢尾甲黄素B、鸢尾甲黄素A、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄素、白射干素作为对照品测定射干提取物及制剂供试品各3批,比较不同对照品对于含量的影响,为总黄酮测定对照品的选择提供数据支持。1.4.依据CNAS-GL006《化学分析中不确定度的评估指南》、JJF 1059-2012《测量不确定度评定与表示》、JJF 1135-2005《化学分析测量不确定度评定》,以射干制剂为研究对象,建立总黄酮含量测定的数学模型,识别不确定度来源,量化不确定度,探讨减小不确定度的可能性。2.薄层色谱质量评价研究改进2020年版药典中射干药材项下的薄层色谱鉴别方法,以药效物质基础成分的斑点数及清晰度等为指标,优化薄层色谱条件:2.1.考察聚酰胺薄膜、硅胶G、硅胶GF254这3种薄层板,确定薄层板种类。2.2.使用甲基-β-环糊精对选定的薄层板进行二次制备,结合Rf值等参数考察:制备方式、甲基-β-环糊精溶剂、甲基-β-环糊精浓度。2.3.结合Rf值等参数考察:展开剂成分、展开距离、展开温度。2.4.使用建立的薄层色谱方法考察供试品6批。3.黄酮苷元质量评价研究及测量不确定度评定采用内标法、外标法及一测多评法分别测定射干提取物及制剂中的黄酮苷元含量,并对3种定量分析方法进行相应的不确定度评定,探讨各分析方法间的差别及各自优势:3.1.内标法:根据文献及前期实验资料,筛选合适的内标物质,完成方法学考察。3.2.外标法:完成方法学考察,建立6种黄酮苷元外标定量法。3.3.一测多评法:以外标法为基础,选取6种药效物质中最易得到的次野鸢尾黄素为内参物（由中国食品药品检定研究院提供）,建立其它5个黄酮苷元成分的相对校正因子;从保留时间差、保留时间比两个参数中选择色谱峰定位依据;从色谱柱品牌、波长、流速、柱温4个方面考察相对校正因子的耐用性。3.4.使用建立的3种黄酮苷元定量方法测定6个批次供试品,比较3种检测方法间的差异。3.5.测量不确定度与测量结果相关联,是定量说明测量结果质量的一个参数,测量结果的可靠性很大程度上取决于其不确定度大小。不确定度采用统计学方法定量给出测量的分散性及可信区间,不确定度越小,说明测量水平越高,测量结果的使用价值越大。本专题依据CNAS-GL006《化学分析中不确定度的评估指南》、JJF 1059-2012《测量不确定度评定与表示》、J JF 1135-2005《化学分析测量不确定度评定》,以射干制剂为研究对象,对黄酮苷元定量方法的不确定度进行评定。分别建立内标法、外标法、一测多评法测定黄酮苷元含量的不确定度数学模型,识别不确定度来源,量化各个不确定度分量,计算3种定量方法的合成不确定度及扩展不确定度,从不确定度角度,比较3种测定方法之间的差异。结果:1.总黄酮质量评价研究1.1.对照品及供试品的均在265nm附近最强吸收峰。1.2.6种对照品在相应范围内均呈线性关系,r≥0.999;分析精密度良好,溶液稳定性良好,样品准确度（回收率）良好,提取物平均回收率为98.99%,制剂平均回收率为98.64%,RSD均<2%。1.3.使用不同对照品测定的总黄酮含量存在一定差异,从低至高依次为:野鸢尾黄素、鸢尾黄素、次野鸢尾黄素、鸢尾甲黄素B、鸢尾甲黄素A、白射干素,最大差异在20%左右。1.4.总黄酮的测量不确定度来源:供试品制备、对照品配制、对照品纯度、仪器、对照品称量、标准曲线拟合、供试品称量,其中对照品纯度和对照品配制、供试品制备是影响不确定度的主要因素,合成不确定度为1.6×10-2。2.薄层色谱质量评价研究2.1.使用药典射干药材项下的薄层条件分离鉴定样品中已知的药效物质基础成分的效果不理想,样品在硅胶GF254薄层板上显示的斑点更清晰明显,且不需要进行显色操作。2.2.二次制备薄层板时,浸泡优于淋洗,浓度1.8%的Me-β-CD优于5%,0.1%H3PO4水溶液优于纯水溶液。2.3.甲酸对拖尾现象的改善优于乙酸;甲醇更的极性调节效果优于乙醚,展开剂确定为二氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸（15:0.2:0.2:0.2）;将展开距离从8cm延长到12cm后,分离效果无明显提升;30℃展开,可比室温展开多分离出一个斑点。2.4.对照药材及6批供试品在Rf值0.50.8附近呈4个相对应的斑点。3.黄酮苷元质量评价研究3.1.内标法:考察了黄芩苷、槲皮素、汉黄芩素、黄芩素4种内标物,黄芩素的保留时间,可兼顾保留时间差异较大的6种待测成分;内标法的线性及范围、精密度、准确度、稳定性考察数据等均符合要求。3.2.外标法:对6种待测成分进行方法学考查,结果显示,线性及范围、精密度、准确度、稳定性考察数据等均符合要求。3.3.一测多评法:选取次野鸢尾黄素作为内参物,计算得到的相对校正因子在6个不同浓度、3个品牌色谱柱、±2℃的柱温波动、10%的流速波动、±3n m的波长偏移下均呈现较好的耐用性,保留时间差的RSD为1.8813.34%,保留时间比的RSD均<3%,因此选取保留时间比作为色谱峰定位依据。3.4.使用3种方法测定的6批供试品的6成分的含量无显著差异。3.5.内标法的不确定度来源包括:供试品制备、标准品制备、黄芩素（内标溶液）称量制备、供试品峰面积、黄芩素纯度、标准品纯度、标准品峰面积、标准品称量、供试品称量,其中黄芩素纯度、标准品制备及标准品峰面积是影响不确定度的前三因素,合成不确定度为2.1×10-22.6×10-2。外标法的不确定度来源包括:供试品制备、标准品制备、供试品峰面积、标准品峰面积、标准品纯度、标准品称量、供试品称量,其中供试品峰面积、标准品峰面积、标准品纯度是影响不确定度的前三因素,合成不确定度为2.1×10-23.6×10-2。一测多评法的不确定度来源包括:供试品制备、标准品制备、供试品峰面积、标准品峰面积、相对校正因子、标准品纯度、标准品称量、供试品称量,其中供试品峰面积、相对校正因子、标准品峰面积是影响不确定度的前三因素,合成不确定度为2.4×10-24.0×10-2。结论:1射干提取物及制剂中抗炎、止咳的药效物质基础均为黄酮类成分,主成分有6种,因此测定总黄酮具有一定的质量评价意义。6个单成分中野鸢尾黄素的占比最高,具有一定的代表性,因此选择了野鸢尾黄素进行方法学研究。不同对照品的对比研究表明,分别以6种有效成分作为对照品测得的总黄酮含量存在一定差异。总黄酮测定的不确定度主要来源是对照品纯度、供试品及标准品溶液制备,使用高纯度对照品、控制室温,注意供试品及标准品溶液制备操作,可一定程度降低不确定度。2药典射干药材项下的薄层色谱条件对射干中抗炎和止咳类成分的质量评价效果不理想,本专题建立了以射干对照药材中抗炎止咳类成分为分离和鉴定目标的薄层色谱鉴别方法,该方法针对性强,更适用于射干提取物及制剂的鉴别,是对射干提取物及制剂质量评价体系的有效补充。3中药材因种质、产地、气候、采收等因素容易出现药效成分含量悬殊、多成分间比例差异大等现象,因此使用多指标质量评价模式可以更客观评价药材质量。内标法、外标法是常用的中药含量测定方法,但由于需要多种对照品,在多指标评价领域的发展面临一定瓶颈。一测多评法是近年来提出的一种新的有望解决多指标测定对照品难题的一种方法。本专题别采用3种方法对射干提取物及制剂进行了方法学研究,并对同批次样品的含量测定结果进行比较,结果显示3者间无显著差异。4测量不确定度作为科学的统计手段,可以合理地表征被测量值的分散性,是定量说明测量结果质量的一个重要参数。本专题对各定量分析方法进行了不确定度评定及比较,内标法的内标物虽然引入了不确定度,但由于存在内标物的校正,仪器等分析因素引入的以峰面积为代表的不确定度分量明显小于外标法,方法的总合成不确定度小于外标法,可认为内标法的测量结果是可信、准确的;外标法不确定度的主要来源是供试品和标准品峰面积,在测定过程中保证测试环境稳定,降低仪器测定过程中的波动,会使外标法的不确定度大大降低;一测多评法的虽然引入相对校正因子,但它并不是不确定度的最大来源,引入的总不确定度增量在可接受范围内,因此采用一测多评方法测定总黄酮苷元含量可行。