春兰‘虎蕊’组织培养及SRAP遗传多样性研究

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春兰(Cymbidium goeringii)作为传统国兰五大类之一,栽培历史悠久,资源丰富,兼具审美、文化和经济价值,是中国传统十大名花之一。种子萌发困难、繁殖系数低、杂交育种周期长等问题一直制约着春兰的发展,近年来,野外挖掘采集也使春兰种质资源遭到破坏。‘虎蕊’为春兰珍品,屡次在兰展中获奖,目前未见对其进行组培研究的报道。针对以上问题,本研究以春兰‘虎蕊’自交后代根状茎为试验材料,运用植物组织培养和SRAP分子标记技术手段,从组培快繁体系建立与优化培养、降低成本的简化培养和遗传多样性分析三方面开展研究,以期提高种苗繁殖效率,降低生产成本,检测变异率,为规模化生产和种质资源的保护利用提供科学依据与技术基础。主要研究结果如下:1.建立并优化了春兰‘虎蕊’组培快繁体系,对根状茎增殖、分化、生根成苗各阶段展开研究,探索了组织培养各阶段的最佳培养基,建立并优化了春兰‘虎蕊’组培快繁体系。研究发现,最适宜春兰‘虎蕊’自交后代根状茎增殖的基本培养基为花宝1号,添加NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+AC 2.0 g/L的培养基,根状茎增殖系数可达4.20;培养基在全自动立式电热压力蒸汽灭菌器121℃下灭菌15 min,根状茎增殖效果最佳;5~10条/瓶为较适合春兰根状茎增殖的接种密度;适宜根状茎分化芽的培养基添加NAA 0.2 mg/L+6-BA 2.0 mg/L,分化率为146.67%,芽高度为2.04 cm;最适宜生根成苗的培养基为添加NAA 0.5mg/L+6-BA 2.0 mg/L+AC 4.0 g/L的培养基。2.对春兰组培的培养基成分、培养步骤及培养光照条件进行了简化研究,以降低组培成本。结果表明,碳源为25 g/L白砂糖时根状茎增殖系数最高,在工厂化生产中可考虑使用白砂糖替代蔗糖以降低成本;自来水与纯净水均为较适合的水质,生产中可以使用自来水替代纯净水;36μmol·m-2·s-1(两根荧光灯管)为较适宜春兰根状茎增殖的光照强度,在生产中可以考虑减为一根灯光或自然的散射光条件进行培养;当6-BA与NAA浓度比值为1~1.3时较利于增殖与分化成苗的同步实现,最适合一步成苗的培养基为:NAA 0.75 mg/L+6-BA 1.0mg/L+AC 2.0 mg/L,根状茎增殖系数为3.65,芽分化率达17.5%,可实现增殖与分化同步进行。3.建立并优化了春兰‘虎蕊’SRAP-PCR反应体系,在此基础上进行亲本与子代间的遗传多样性研究。最优体系为:模板DNA用量60 ng,引物浓度0.5μmol/L,d NTPs浓度0.3 mmol/L,Mg2+浓度3.0 mmol/L,Ex Taq酶用量0.5 U,该体系稳定可靠,可为后续的相关研究建立基础;筛选出16对适宜春兰‘虎蕊’SRAP-PCR扩增的引物,进行遗传多样性进行分析,共扩增出219条清晰可辨的条带,平均每对引物扩增出13.69个条带,多态性比例达65.30%,表明分子标记的多态性较好;亲本与子代群体间的平均遗传相似系数为0.8167,子代间的平均遗传相似系数为0.8145,两者变异程度相接近,表明春兰亲本与子代、子代与子代之间的遗传相似性均较高,其遗传较稳定。本研究为进一步研究建立更多春兰名品的组培快繁体系及名贵国兰品种的规模化工厂化生产打下了研究基础。
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