论文部分内容阅读
帕金森病(Parkinson’s Disease, PD)是与年龄有关的神经退行性疾病,它的特征是中脑黑质区多巴胺能神经元选择性死亡,患者的主要表现为动作缓慢,手脚或身体其他部分震颤,身体变得僵硬。帕金森病的发病是一个复杂的生物学过程。迄今,对患者多巴胺能神经元特异性死亡的问题仍未解决,一般认为多巴胺能神经元死亡的机理涉及四大方面的因素：线粒体功能障碍、炎症反应、蛋白质代谢异常和氧化应激。氧化应激是导致PD的主要原因之一。而氧化应激的来源很可能与神经递质多巴胺氧化后产生的多巴胺醌和活性氧有关。研究表明作为Ⅱ相酶之一的依赖还原型辅酶Ⅰ/Ⅱ的醌氧化还原酶1(NAD(P)H:Quinone Reductase, NQO1)能阻断多巴胺形成多巴胺醌,同时减低多巴胺氧化过程中形成的过氧化物,降低氧化应激反应,保护神经细胞。NQO1基因表达调控的主要元件是抗氧化应答元件(Antioxidant Response Element, ARE)。本实验建立了一株由ARE调控,可以表达荧光素酶的SH-SY5Y稳定细胞系,该细胞系可以用于筛选Ⅱ相酶诱导剂。然后我们在该细胞系基础上鉴定出羟化酪醇(Hydroxy Tyrosol, HT)具有Ⅱ相酶诱导能力,并证明了HT具有保护SH-SY5Y细胞免受多巴胺毒性的功能,并初步探讨了这种保护作用的机理。具体实验结果如下：1.构建由ARE调控的可表达荧光素酶的单克隆稳定细胞系,用已知的Ⅱ相酶诱导剂萝卜硫素(SμLforaphane, SF)对其进行了鉴定。我们选用携带荧光素酶的pGL3-Basic质粒作为基础,分别将新霉素抗性基因(neo)片段和合成的带最小启动子区段的ARE片段连入质粒中,最终获得pGL3-neo-ARE质粒。用脂质体将其转染入SH-SY5Y细胞,用遗传霉素(Geneticin, G418)筛选,再用有限稀释法选出多个候选单克隆细胞系。在这些候选细胞系中,用萝卜硫素对其进行了鉴定,检测其诱导表达的荧光素酶活性,最终建立了一株受ARE元件调控,可诱导表达荧光素酶的SH-SY5Y-ARE细胞系。最后,通过Western Blot和NQO1酶比活实验进一步验证了SF对SH-SY5Y-ARE细胞系和野生型SH-SY5Y细胞系均具有NQO1诱导作用。2.羟化酪醇(Hydroxy Tyrosol, HT)对SH-SY5Y细胞保护作用的初步研究首先,在SH-SY5Y-ARE系中,对HT诱导荧光素酶活性的能力进行了测定,发现HT诱导的荧光素酶活性随着HT浓度增加而提高。进而通过Western Blot和NQO1酶比活实验也证明了：受HT诱导的NQO1表达水平或活性也随着HT浓度增加而提高。其次,对HT诱导NQO1表达的持续时间进行了分析,发现HT诱导后移去,NQO1表达仍可以持续至少24小时。最后,对细胞进行HT处理后,其抵抗DA细胞毒性的能力进行了分析。发现：用HT处理细胞24h后,该细胞具有抵抗DA细胞毒性的能力。说明HT对细胞免受DA的毒性具有保护作用。而在HT处理的同时加入NQO1抑制剂双香豆素后,该保护作用即消失。说明HT具有保护SH-SY5Y细胞免受DA毒性的功能至少部分是通过诱导NQO1的表达实现的。此外,我们还分析了另一种重要的Ⅱ相酶谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-Transferase, GST)受HT诱导后的表达情况,并未发现GST有显著升高。结论,我们的实验结果表明：HT可通过诱导NQO1的表达来提高细胞对DA毒性的抵抗力。这是在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系上,首次证明了HT具有保护SH-SY5Y细胞免受DA毒性的功能,说明HT是一种具有潜在价值的PD的预防或治疗药物。