论文部分内容阅读
目的：Toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)是内毒素(LPS)的关键受体,为Toll蛋白家族中的一个成员,是联系固有免疫和适应性免疫的纽带。TLR4主要表达于髓源性细胞,其启动的胞内信号转导在肝损伤的发生和发展过程中发挥重要作用。核因子-KB(nuclear factor-kappa B,NF-KB)是广泛存在于哺乳动物细胞中的一种重要转录调控因子,能与多种细胞基因的启动子和增强子序列位点发生特异性结合,通过调控多种重要的细胞因子、粘附分子和趋化因子的表达,在机体的免疫应答、炎症反应及细胞的生长调控等方面发挥重要的作用,其活化也参与细胞增殖和凋亡的过程。本实验通过建立2型糖尿病(T2DM)大鼠模型,动态观察TLR4和NF-KB在肝组织中的表达情况,探讨免疫炎症机制在2型糖尿病肝脏病变中的作用。方法：将清洁级SD大鼠随机分为正常对照组(NC组),胰岛素抵抗组(IR组),糖尿病4周组(DM4w组)和糖尿病8周组(DM8w组),均普通饲料喂养。IR组、DM4w组、DM8w三组连续7周按1ml/100mg体重/d给予脂肪乳灌胃,NC组按同样剂量给予水灌胃对照。第7周末测定血糖及胰岛素,计算并比较各组胰岛素水平,显示脂肪乳灌胃组(即IR、DM4w、DM8w组)胰岛素高于NC组。遂于次日清晨称取动物体重,按30mg/kg体重尾静脉注射STZ。3天后,血糖测定结果大于16.7mmol/l为2型糖尿病造模成功。造模后继续普通饲料喂养和脂肪乳灌胃(0.5ml/100mg体重/d)。动物处死前股动脉取血,测定空腹胰岛素(FINS)、空腹血糖(FPG)、糖化血清蛋白(GSP)、血脂等生化指标。应用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定大鼠肝脏组织胰岛素受体,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测大鼠肝脏组织TLR4 mRNA的表达,免疫组化测定肝脏组织中NF-KB蛋白的表达。所得数据用SPSS11.5统计软件分析。结果：高糖高脂饮食7周后,与对照组相比,脂肪乳灌胃三组血清胰岛素升高明显,差异有统计学意义(P<0.05),ISI明显降低,HOMA-IR明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)；STZ诱导后,2型糖尿病大鼠全部成模。实验结束时,大鼠的ALT、AST、GSP于NC组、IR组、DM4w组、DM8w组中递增,差异有统计学意义(P<0.05)。DM4w组和DM8w组的FBG、TG、TC高于NC组和IR组,差异有统计学意义(P<0.05)。与NC组比较,其他3组的FINS、LDL-c、FFA均高于NC组,而HDL-c均低于NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA法测定大鼠肝脏组织胰岛素受体水平结果示,与NC组比较,R组、DM4w组、DM8w组大鼠肝细胞膜胰岛素受体水平升高有统计学意义(P<0.05)；RT-PCR检测大鼠肝脏组织TLR4 mRNA的表达结果示,TLR4 mRNA表达水平于NC组、IR组、DM4w组、DM8w组中递增,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组化测定肝脏组织中NF-KB蛋白的表达结果示,NF-KB蛋白的表达水平亦于NC组、IR组、DM4w组、DM8w组中递增,差异有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关分析示,TLR4 mRNA与NF-KB蛋白表达(r=0.706,P<0.01)、ALT(r=0.974, P<0.01)、AST(r=0.950,P<0.01)均呈正相关。NF-KB蛋白表达与ALT(r=0.657, P<0.01)、AST(r=0.646,P<0.01)呈正相关。结论：(1)脂肪乳灌胃(高糖高脂饮食)7周加小剂量一次尾静脉注射STZ可以成功诱导SD大鼠的2型糖尿病模型,方法可靠,可全部成模；(2)胰岛素抵抗和2型糖尿病大鼠肝细胞膜上的胰岛素受体数目增多,可能与胰岛素敏感性及作用下降有关；(3)随着糖尿病的进展,肝脏组织中TLR4及NF-KB的表达水平增加,且与肝脏组织的损害呈正比,证实TLR4/NF-KB信号通路的炎症反应在2型糖尿病的发生、发展及肝脏组织的脂肪变性中起到重要作用。