柑橘纯合种质创制及早金甜橙DH系代谢与转录组分析

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纯系材料在植物育种及基因组学研究中发挥着重要作用。然而,由于柑橘具有高度杂合性、童期长、树体庞大、珠心胚和某些品种自交不亲和等特性,采用常规育种途径在柑橘上很难获得纯合种质。诱导配子体胚胎发生,包括花药培养、小孢子离体培养、诱导孤雌生殖、离体子房培养等,可以直接获得完全的纯系材料,省时省力。自上世纪70年代,柑橘通过诱导配子体胚胎发生已获得一些纯合材料,然而这些纯系大都具有相似的遗传背景,且都存在再生困难的问题,使得柑橘纯系种质资源种类及数量无法达到应用的要求,限制了柑橘纯系材料的应用。本文通过花药培养和诱导孤雌生殖的方法,创造柑橘纯系种质,以拓展柑橘纯合种质资源类型及数量;对早金甜橙及其DH系进行芳香烃代谢及转录组差异分析,评价其单倍化过程中代谢及基因表达变化。主要结果如下:1、花药培养诱导柑橘纯系。通过四种诱导培养基对15个柑橘品种进行花药培养诱导,并对诱导获得的全部胚状体及愈伤组织进行倍性及分子标记鉴定,获得了早金甜橙(Citrus sinensis Osbeck)单倍体系15个,纯合二倍体系10个(其中2个DH系已再生植株,为甜橙纯合植株诱导成功的首次报道),同源四倍体系2个;红夏橙(C.sinensis Osbeck)单倍体愈伤组织系1个;暗柳橙(C.sinensis Osbeck)单倍体愈伤组织系2个;鸡尾葡萄柚(C.paradis Macf.)单倍体愈伤组织系1个(为葡萄柚纯系诱导成功的首次报道)。利用均匀分布于柑橘9条染色体的31对SSR引物对早金甜橙16个纯系的遗传组成进行深入分析,证实这些纯系的纯合性为100%,并且起源于不同基因型的小孢子;通过对其带型统计进行小孢子等位基因分离规律分析,表明在29个双带位点中,有16个位点的等位基因分离遵循1:1的分离规律。2、诱导孤雌生殖创制柑橘纯系。利用γ射线辐射的枳(Poncirus trifoliata Raf.)和铜城72-1锦橙(C.sinensis Osbeck)不同辐射剂量的花粉对HB柚(C.grandis Osbeck)、高班柚(C.grandis Osbeck)、凤凰柚(C.grandis Osbeck)、华农红柚(C.grandis Osbeck)、秋辉橘橙([C.reticulata Blanco×(C.paradis Macf.×C.reticulata Blanco)]×(C.reticulata Blanco×C.sinensis Osbeck))以及尤力克柠檬(C.limon Burm.f.)6个柑橘单胚或者单多胚混合品种授粉诱导孤雌生殖。花粉活力检测表明辐射对花粉活力没有影响;授粉后对花粉管行为进行观察发现,辐射后的花粉管可以正常萌发伸长至胚珠。经胚挽救,对获得的植株进行倍性及分子标记鉴定,确定获得HB柚单倍体4株,同时由HB柚×255Gy枳授粉组合获得三倍体1株、由华农红柚×500Gy枳授粉组合获得三倍体1株。核型分析和分子标记确定了HB柚单倍体来源于孤雌生殖。3、三倍体花粉诱导孤雌生殖。利用三倍体葡萄柚Melgold(C.paradis Macf.)与Oroblanco(C.paradis Macf.)的花粉对HB柚、高班柚、凤凰柚、华农红柚、秋辉及沙田柚(C.grandis Osbeck)6个柑橘单胚品种授粉诱导孤雌生殖,通过胚挽救并对获得的植株进行倍性鉴定,确定由HB柚×Melgold授粉组合获得三倍体植株7株,由高班柚×Melgold授粉组合获得三倍体1株,由秋辉×Oroblanco三倍体组合获得四倍体1株。4、早金甜橙及其DH系芳香烃代谢及转录组差异分析。对早金甜橙及其DH系叶片进行形态学分析,其叶面积、翼叶面积、叶面积与翼叶面积比及叶形指数均存在显著性差异。通过GC-MS对芳香烃代谢产物进行鉴定分析,共检测到45种芳香烃类化合物,其中42种物质含量存在显著性差异;在DH系,其总含量高于早金甜橙,含量上调积累的有12种,含量下调积累的有30种,其中20种物质未检测到。通过RNA-seq对基因表达差异进行分析,以FDR≤0.001且表达量≥2倍为筛选标准,共筛选到差异表达基因1863个,占总基因量的5.77%;其中DH系上调表达基因506个(占总差异基因的27.16%),下调表达基因1357个(占总差异基因的72.84%)。这些差异基因主要参与防御、逆境及刺激响应、代谢及细胞死亡等生物过程,其中上调表达差异基因还参与芳香化合物合成过程,这可能是引起DH系芳香烃代谢差异的主要原因。
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