抗菌肽是一类含有半胱氨酸的阳离子肽,存在于多种生物中。能够抗革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、原虫、病毒等多种微生物,是天然免疫反应的主要组成部分,是连接大然免疫和获得性免疫反应的纽带。抗菌肽能快速启动免疫系统,在机体抵抗病原微生物中具有重要作用。肺泡巨噬细胞是机体清除病原微生物的重要部位。LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁成分,LPS刺激TLRs后能引起炎症反应,激活巨噬细胞及单核细胞后能促使炎症因子的释放。因此本文以绵羊肺泡巨噬细胞为研究对象,利用转录组测序技术筛选免疫相关基因,并对所获得基因进行克隆、诱导表达以及生物学功能检测,为动物抗病育种与疫苗免疫佐剂的研究提供理论基础。本研究主要包括以下内容：(1)采用Solexa测序技术对绵羊肺泡巨噬细胞的转录组进行测序。对LPS诱导的肺泡巨噬细胞和未诱导的巨噬细胞分别进行测序,寻找免疫相关基因。将测序所得conting经拼接后获得67734条Uningene,其中发现54019条是新Unigene。其中64%Unigene与牛的基因序列具有同源性。差异表达基因GO功能显著性富集分析,发现182个免疫相关基因。未诱导巨噬细胞和诱导巨噬细胞之间存在差异表达基因,并发现新的免疫相关基因,说明转录组测序技术筛选新基因是有效可行,这将为基因工程方法表达蛋白和生物学功能研究提供材料。(2)NK-Lysin基因在毕赤酵母中的诱导表达。利用RT-PCR法扩增出441bp NK-Lysin基因,并插入至表达载体pPIC9K后,获得重组质粒pPIC9K-NK-Lysin经PCR、酶切、测序鉴定正确后,电转到酵母菌GS115,在4.0%遗传霉素培养板中挑取阳性菌,经0.5%甲醇诱导,绵羊NK-Lysin获得了分泌表达,为大量获得绵羊NK-Lysin奠定了基础。(3)NK-Lysin基因原核表达及活性初步检测。成功构建了原核表达载体pET32a-NK-Lysin,在诱导剂IPTG终浓度为0.5mmol/L和37℃下诱导表达了37KDa的融合蛋白。融合蛋白NK-Lysin经纯化后进行抑菌试验,表现出对致病性大肠杆菌和李斯特杆菌具有抑菌活性。为开展抗菌肽类抗生素替代物研究提供了科学依据。(4)绵羊NK-Lysin的诱导表达及组织分布研究。用荧光实时定量RT-PCR检测NK-Lysin mRNA在不同LPS诱导条件下和不同免疫器官中的相对表达量。在LPS不同诱导条件下NK-Lysin mRNA的表达量,当LPS的浓度为0.1μg/mL时,4h的表达量与其它时间段相比差异极显著(P<0.01)；在8h时,LPS的浓度为0.01μg/mL,表达量达到最大；LPS的浓度为100μg/mL时,NK-Lysin基因在4个时间段均未表达；在不同免疫器官中此基因在三只羊的肩前淋巴结、脾脏及血液中均有不同程度的表达,脾脏中表达量与其它组织中的表达量相比差异极显著(P<0.01)。NK-Lysin基因的表达量与LPS的浓度及诱导时间有关,并在免疫器官中的分布存在差异。(5)绵羊GM-CSF原核表达及蛋白对免疫细胞影响的观察。将GM-CSF基因克隆至原核表达载体pET-32α中,转化至BL21中,用智能蛋白质多维纯化系统纯化蛋白,利用MTT法测定GM-CSF融合蛋白对绵羊外周血淋巴细胞的增殖活性。成功获得了435bp的绵羊GM-CSF基因片段,诱导表达了35KDa融合蛋白GM-CSF,其纯度达95%以上,浓度达860mg/mL;通过MTT证明该融合蛋白对绵羊淋巴细胞具有增殖活性,其作用最明显的蛋白浓度是200μg/mL。重组蛋自GM-CSF对淋巴细胞具有较好增殖作用,说明该蛋白具有较好的生物活性,为免疫增强佐剂的开发奠定基础。以上试验表明,用转录组及Solexa测序技术构建文库是有效可行的,并且筛选出182个免疫相关的基因；成功构建了真核表达载体pPIC9K-NK-Lysin,并在酵母菌GS115中成功表达；重组蛋白pET32a-NK-Lysin对致病性大肠杆菌和李斯特杆菌均有抑制作用；并对NK-Lysin基因的表达量做了Q-RT-PCR分析：这将为抗病育种基因的选择提供依据。重组蛋白GM-CSF可以作为免疫增强佐剂。