论文部分内容阅读
Harpin蛋白是由植物病原细菌产生的富含甘氨酸、对热稳定对蛋白酶K敏感的一类蛋白。它在非寄主植物上能够引起过敏反应,而且是植物病原细菌的一个重要的致病因子。另外,harpin蛋白还能够诱导植物产生病虫抗性以及提高作物的产量与改善作物品质。确定了一个来自于黄单胞菌的harpinX蛋白中的关键的功能区域,该段区域抑制harpinX蛋白在大肠杆菌中的蛋白凝集并对其表达有重要影响。对harpinX蛋白的突变研究表明,harpinX蛋白的两个主要特征:富含甘氨酸和缺乏半胱氨酸对激发HR反应和热稳定性并不是必须的。有趣的是,利用生物信息学手段对水稻黄单胞harpinX(HpaG,harpinXoo和harpinXooc)蛋白进行分析后,发现它们含有两个保守区,用定点突变技术缺失了N端的高度亲水的保守序列的突变体丧失了过敏反应活性。而这个含有12个氨基酸（QGISEKQLDQLL）的二级结构预测为一个a-螺旋。进一步的研究表明,缺失了该段序列的三个突变体,在37℃诱导时,其表达产物都不能在烟草上诱导过敏反应;而在24℃诱导时,其中两个突变体又可以诱导过敏反应,但表达水平和野生型相比却大大下降。SDS-PAGE和Western blot分析发现HpaG的突变体几乎完全以包涵体形式存在。这些结果表明该段序列在harpinX蛋白的折叠和凝集反应中起着关键性的作用。利用定点突变分别将HpaG,harpinXoo和harpinXooc的第50,51,53位的亮氨酸替换为脯氨酸,得到了三个突变体HpaG（L50P）,harpinXoo（L51P）和harpinXooc（L53P）。这三个点突变的蛋白,即使在10μM的浓度下,在烟草上也不能引起HR反应。这一结果表明,这个亮氨酸是harpinX蛋白诱导HR活性的关键氨基酸。九个蛋白突变体喷施处理烟草后观察其抗病反应,分析结果显示,丧失诱导HR活性的蛋白突变体依然可以诱导抗病性。且HpaG（L50P）,harpinXoo（L51P）和harpinXooc（L53P）也可以诱导烟草对烟草花叶病毒的抗性,而且与野生型相比抗病效果没有明显差别。进一步对三个突变体蛋白喷施处理烟草后诱导抗病信号传导相关基因的表达情况进行了分析,以pET30（a+）空载体表达产物处理烟草作对照。结果显示,丧失诱导HR活性的蛋白突变体,也可以诱导和抗病信号传导相关的基因的表达。这提示诱导抗病性与引起HR反应之间并没有必然的联系,HR和SAR可能是两条信号通路介导的,或者是在某一上游因子处形成分支。异源蛋白在大肠杆菌中的高效表达的影响因子中,密码子的偏爱是一个较重要的因素。稀有密码子导致核糖体在和tRNAs结合时需要或多或少的氨基酸,当某一结合位点的氨基酸在表达时被消耗过多,就会造成转录错误。基于此,作者优化了hrf2基因并进行合成,将优化基因连入表达载体pET（30a+）并在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。但结果显示优化过的hrf2syn基因并没有获得高水平表达,而是比原基因的表达水平略有下降。什么影响了hrf2syn基因的高水平表达?对hrf2syn基因的mRNA反转录PCR和实时定量PCR分析表明,tRNA丰度并不是影响基因高水平表达的必要因素,mRNA的二级结构可能是主要的影响因子。另外,利用基因的密码子优化是一个强有力的提高表达效率的工具,但在优化的同时一定要避免阻碍表达的特殊的mRNA的二级结构的形成。用Bulk GST Purification Module和Thrombin Cleavage Capture Kit两个试剂盒对harpinX进行了纯化。每升诱导培养细胞可收获纯化harpinX蛋白≥6 mg,纯化蛋白的浓度达到了1.5-2.0 mg/ml。SDS-PAGE分析表明蛋白纯度可达到90-95%经过随后用脱盐柱对harpinX蛋白进行了脱盐。大于5Kda的蛋白分子进入柱子空隙,盐类等小分子则被先洗脱下来。随后用Pre-Screen Assay筛选蛋白结晶最优的起始浓度。蛋白可在各种状态下形成结晶,寻找到正确的结晶条件具有很大的挑战性。应用蛋白结晶中广泛采用的悬滴法,即包含有低浓度沉淀剂（比如盐类）悬于盛放较高浓度沉淀剂的储池上面。悬滴和储池之间进行水蒸汽交换浓缩了悬滴浓度。当悬滴中的蛋白浓度超出其溶解度时,蛋白就会沉淀。如果蛋白很纯且沉淀过程很慢,蛋白就有可能结晶。而在不合适的条件下,蛋白就会形成不定型固体或凝胶。利用Hampton公司的Crystal Screen Kit我们得到了一些初步的结果:添加了过硫酸铵,PEG系列（2000,4000,8000）的组合沉淀剂容易使harpinX蛋白沉淀,对于沉淀来讲,进一步的优化可能会从中得到蛋白结晶。这提示我们应用这些组合成份有可能得到结晶。