研究背景和目的吸毒是全球普遍存在的严重社会卫生问题，在我国形势也日趋严峻，以海洛因滥用者为主体。毒品滥用已成为许多国家仅次于心脑血管疾病和恶性肿瘤的第三位致死病因。因此，毒品的中枢性毒害作用以及依赖机制已成当今研究的热点问题。海洛因作为硬性毒品之王，属于阿片类药物。对阿片类药物成瘾机制和神经损害的研究主要集中于阿片受体及其阿片肽系统，通过各种复杂的神经体液机制调节体内多种神经递质、调质、内分泌、离子通道及细胞内信号传导系统的作用。但是，阿片成瘾的确切机制尚未明了。传统的方法很难完全阐明毒品的毒性作用，包括病理性损伤机制以及成瘾性机制等关键问题，而组学研究，开辟了全面、系统把握生命现象之特征的研究道路。蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质的结构和功能的研究将直接阐明生命在生理和病理条件下的变化机制。由于中脑—边缘多巴胺(DA)奖赏或强化神经系统与皮层-基底节回路是参与药物成瘾相关的重要的通路，而且前额叶皮质(PFC)、伏隔核(NAc)、海马和纹状体在两个密切相关的通路中扮演重要角色，因此本研究通过双向电泳(2-DE)技术筛选这四个脑区的差异蛋白表达谱，结合基质辅助解析飞行时间质谱鉴定这些差异蛋白和标志性蛋白位点，寻找蛋白的差异表达以及修饰变化，揭示其功能的变化和蛋白之间的相互作用，有可能从机理上揭示海洛因导致的依赖和毒性作用，包括病理性损伤机制以及成瘾性机制等的最新途径。方法1．海洛因成瘾戒断大鼠模型的建立及病理学观察成年雄性Wistar大鼠，随机分成3组，设计海洛因初始剂量为4mg／kg体重，每天递增4mg／kg体重，腹腔注射，3次／天，共10天，建立海洛因成瘾模型；停药后3天作为自然戒断大鼠模型；并以生理盐水代替海洛因注射作为对照组。利用纳洛酮催促戒断反应，观察戒断症状并根据改进的柳田知司评分标准进行评分；记录大鼠模型制作过程中不同时间体重变化。对各组的内脏器官和脑组织进行病理学观察，并应用免疫组化手段检测脑损伤标志分子GFAP的表达变化。2．海洛因成瘾和正常大鼠相关脑区DA和代谢产物DOPAC的检测参照大鼠脑立体定位图谱，分离海洛因成瘾组和对照组各6只大鼠PFC、NAc、海马和纹状体等脑组织，制备样品，利用高效液相色谱技术，检测对照组和海洛因成瘾组大鼠各相关脑区中的DA以及代谢产物DOPAC的含量，并观察二者比值。3．大鼠不同脑区双向电泳条件的建立选择合适的组织裂解液，参照大鼠脑立体定位图谱，分离PFC、NAc、海马和纹状体等脑区组织抽提蛋白，并经冷丙酮沉淀除盐，制备双向电泳蛋白样品，经改良Bradford法检测蛋白浓度；选择pH3～10线性固相pH梯度预制胶(IPG)，利用2—DE技术在pH3-10范围内分离蛋白，分别用银染法(上样量200μg)和考马斯亮蓝Blue silver染色法(上样量1mg)对凝胶进行染色，并对两种方法进行比较。4．海洛因成瘾戒断大鼠和对照大鼠相关脑区差异蛋白的筛选和MALDI-TOF—TOF-MS鉴定选择pH4～7线性IPG，在上述2—DE条件下对海洛因成瘾、戒断和正常对照3组大鼠相关脑区蛋白样品行2—DE分离，考马斯亮蓝Blue silver染色法对凝胶进行染色；所得凝胶图谱借助图像分析软件包ImageMaster 2D Platinum 5.0进行图像分析，同一脑区不同组之间的蛋白质表达水平上升或下降200％的点选择为目标点；随后筛选重复性和分离效果好的差异蛋白点进行MALDI-TOF—TOF-MS鉴定；所得肽质量指纹图(PMF)和串联质谱图，用GPS-MS进行数据库检索，数据库选择NCBInr，鉴定筛选的差异蛋白。5．神经颗粒素(Ng)在海洛因成瘾戒断大鼠脑组织中的表达采用western blot和免疫组化方法在蛋白水平上验证Ng在海洛因成瘾戒断大鼠脑组织中的表达。结果1．海洛因成瘾、戒断大鼠模型成功建立纳洛酮催促戒断反应后，海洛因注射组戒断症状得分与对照组比较具有显著性差异(t=19.094，P=0.000)，标志着海洛因注射后大鼠已经产生药物依赖。海洛因注射组和对照组在模型制作过程中体重变化自注射第3天起具有显著性差异(F=41.412，P=0.000)；海洛因停药后第2天大鼠体重下降，与对照组相比差异显著(t=9.889，P=0.000)；组织学观察可见海洛因注射组肝脏部分肝小叶有水肿、轻度脂肪变，2只成瘾模型肾脏肾小管有蛋白管型；脑组织超微结构发现少量PFC和海马神经元变性；GFAP免疫组化结果显示PFC和海马CA1区，海洛因成瘾、戒断组PU值(阳性单位)与对照组比较有显著性差异(F=36.772，P=0.000；F=105.534，P=0.000)，并且发现用药组GFAP阳性表达无组织特异性。2．海洛因成瘾大鼠相关脑区多巴胺及其代谢产物DOPAC的变化高效液相色谱结果发现除海马外，其它3个脑区DA和DOPAC的含量发生明显变化，与对照组相比，其中PFC和NAe显著性升高(t=36.617，P=0.000；t=16.017，P=0.000；t=16.991，P=0.000；t=4.186，P=0.002)，而成瘾组大鼠的纹状体中二者含量却显著下降(t=32.642，P=0.000 t=50.457，P=0.000)；成瘾组PFC的DOPAC／DA值显著高于对照组(t=7.429，P=0.000)；而NAc和纹状体却显著降低(t=15.535，P=0.000；t=16.673，P=0.000)。3．大鼠不同脑区双向电泳条件的凝胶图谱分析比较其它电泳条件优化前提下，分别用银染法和马斯亮蓝Blue silver对凝胶进行染色，经比较发现各脑区银染的凝胶图谱都存在重复性差，得到的蛋白点少等等，而应用考马斯亮蓝Blue silver对凝胶进行染色，发现重复性好，分离效果二者相差不大。并发现各脑区蛋白主要集中在pH4～7范围内。4．海洛因成瘾、戒断大鼠和对照大鼠相关脑区差异蛋白的筛选和MALDI-TOF—TOF-MS鉴定在pH4～7范围内2—DE分离3组大鼠PFC、NAc、海马和纹状体组织的蛋白，经图像分析，以上4个脑区在3组之间分别筛选出8、10、5、7个差异蛋白点，经MALDI-TOF-TOF-MS分析，成功鉴定27个蛋白点，共计18个蛋白。(1)在PFC中，仅在成瘾组和戒断组出现的蛋白是葡萄糖调节蛋白58(glucose regulated protein,GRP58；又称ERp57，ER60)和26s蛋白酶体亚基p40.5(26S proteasome subunit p40.5)而且表达量相当；相对于对照组和成瘾组，戒断组的泛素连接酶E2N(Ubiquitin-conjugating enzyme E2N)表达升高；成瘾组和戒断组含量下调的蛋白是ATP合酶D链；成瘾、戒断组与对照组相比，Ndufa10[NADH dehydrogenase(ubiquinone)alpha subcomplex-10]和α-烯醇化酶(Enol)发生相对分子质量和(或)等电点迁移，Enol的MW和pI差异更加明显。(2)在NAc中，仅在成瘾组和戒断组出现的蛋白是Grp58，在两个实验组中都表达升高的蛋白是参与ATP合成的线粒体F0复合体F6亚基(ATP synthase，H+transporting，mitochondrial F0 complex，subunit F6)，而载脂蛋白酶E(Apolipoprotein E，apoE)、低分子量磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶同工酶AcP2(low M(r)phosphotyrosine protein phosphatase isoenzyme AcP2)和ADP—精氨酸核糖基化水解酶(ADP-ribosylarginine hydrolase，AAH)在成瘾组中表达下降，仅在对照组出现的蛋白是表皮型脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein 5，epidermal)；Ndufa10的表达情况与PFC脑区基本相同。(3)在海马组织中，神经颗粒素(neurogranin，Ng)曲在海洛因成瘾、戒断组表达明显升高；戒断组微管蛋白α1表达升高；但mVps29p表达量在正常组、成瘾组和戒断组中依次降低；Ndufa10的表达情况与PFC脑区基本相同。(4)在纹状体中，海洛因成瘾组和戒断组表达升高的蛋白是Zn结合乙醇脱氢酶(Zinc binding alcohol dehydrogenase)和G蛋白解离抑制因子2[Guanosine diphosphate(GDP)dissociation inhibitor 2,GDI2]，而两组的NAD~+依赖的异柠檬酸脱氢酶[isocitrate dehydrogenase 3(NAD+)alpha]表达降低；原肌球调节蛋白2(tropomodulin,TMOD2)在戒断组表达下降；Ndufa10的表达情况与PFC脑区基本相同。5．神经颗粒素(Ng)在海洛因成瘾戒断大鼠脑组织中的表达验证Western blot结果表明各组在6.5～14.4Kda之间均显示一条较粗的Ng免疫印迹反应条带，海洛因成瘾、戒断组含量明显高于对照组；免疫组化结果显示Ng阳性表达主要在海洛因成瘾、戒断脑组织的皮质和海马组织，其它脑区未见明显表达。PFC和海马CA1区Ng的阳性产物的PU值各组总体比较差异显著，有统计学意义(F=53.552，P=0.000；F=48.861，P=0.000)；PFC脑区，成瘾组、戒断组的PU值与对照组比较均有显著性差异(P=0.000，P=0.000)，而成瘾组和戒断组比较没有统计学差异(P=0.535)；海马CA1区，成瘾组、戒断组的PU值与对照组比较均有显著性差异(P=0.000，P=0.000)，成瘾组和戒断组比较差异有统计学意义(P=0.022)。结论1．成功建立了海洛因成瘾和自然戒断大鼠模型，并且发现海洛因对中枢神经系统造成轻度损害。2．各组DA和DOPAC结果进一步证明了以NAc为核心的中脑多巴胺奖赏系统参与阿片类药物成瘾的形成过程，DA是参与海洛因成瘾形成的重要的神经递质。3．建立了良好的2—DE条件，在此基础上成功鉴定了27个蛋白位点即18个蛋白，根据功能可以划分为分子伴侣蛋白，蛋白质降解相关蛋白，功能蛋白修饰相关蛋白，信号转导蛋白，细胞骨架蛋白，能量及物质代谢相关的酶，功能涉及神经保护和毒害两个方面。由结果可知，海洛因成瘾、戒断必然引起神经细胞的适应性病理改变，这个过程必然涉及神经细胞结构、突触可塑性、细胞运输与突触运输、信号转导、功能蛋白的降解或修饰以及能量代谢等方面的改变。4．海洛因成瘾、戒断后在四个脑区中被特异修饰的Ndufa10广泛分布；在PFC和NAc脑区，海洛因成瘾、戒断大鼠表达新蛋白Grp58。两个蛋白可能是海洛因依赖的标志性蛋白，但需要进一步研究证实。5．Ng在成瘾戒断大鼠的海马和PFC表达上调，提示学习记忆通路中的关键蛋白Ng在海洛因依赖相关学习记忆形成中扮演重要角色。