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CREB(cAMP反应元件结合蛋白)/ATF(激活转录因子)家族是真核生物中广泛存在的一类基础转录因子,该家族共同的结构特征是碱性亮氨酸拉链(bZIP)模体。CREB/ATF家族蛋白涉及到细胞的增殖、分化、凋亡、胞外刺激和应激反应等细胞生命过程。CREB2、CREB3和CREB3L4是ATF/CREB家族中三个重要的成员。本文以梅山猪为研究对象,首次对猪CREB家族的这三个基因及CREB3L4的剪接体进行了基因克隆,通过PCR扩增获取基因组序列并对其进行基因结构分析,利用辐射杂种细胞板技术和半定量RT-PCR等方法进行了基因的染色体定位和组织表达分析;另外还克隆猪CREB3启动子区域并构建了pGL3荧光素酶报告载体,利用实时定量PCR方法检测脂多糖刺激后CREB3 mRNA相对表达量,并利用双荧光素酶检测试剂盒检测脂多糖刺激后CREB3的启动子活性是否变化。研究结果如下:1.扩增得到猪CREB家族三个成员的的cDNA序列,包含全长编码区及部分非编码区,并对其进行了生物信息学的分析。其中CREB2编码区为1047bp,编码378个氨基酸;CREB3编码区为1098bp,编码375个氨基酸;CREB3L4 varant1和varant2编码区分别为1188bp和816bp,分别编码395和271个氨基酸。在蛋白质水平上,CREB2与人、小鼠CREB2分别享有85.8%,71.7%的相似性;CREB3与人、小鼠CREB3分别享有72.6%和65.0%的相似性;CREB3L4与人、小鼠CREB3L4分别享有82.5%和61.1%的相似性。2.扩增获得CREB家族这三个成员的基因组序列并分析它们的基因结构。CREB2基因组长度为2069bp,包含三个外显子和两个内含子;CREB3基因组长度大约为5.3kb,包含九个外显子和八个内含子;CREB3L4基因组长度大约为6.3kb,包含十个外显子和九个内含子。这三个基因所有的外显子和内含子的交界都符合GT/AG法则。根据所得到的基因组序列,利用辐射杂种板技术将CREB2、CREB3和CREB3L4分别定位在5p、1q28和4q。并且通过比对猪.人比较基因组图谱证实这两个基因的定位结果与人相应基因在染色体上的位置相对应。3.以梅山猪的脂肪组织、骨骼肌、心、胃、肝、肺、脾、肠、脑、肾、淋巴等十一个组织样品为材料,利用半定量RT-PCR的方法研究了CREB家族这三个成员在mRNA水平上的组织表达谱。结果表明CREB2、CREB3和CEEB3L4在组织中广谱性表达。CREB2和CREB3均在白色脂肪组织、胃、肾肺、小脑、肝脏和淋巴几个组织中高表达。CEEB3L4 variant1在肝脏和胃中表达量较高,中度表达与小脑中,其次是脾、白色脂肪组织和淋巴组织,然而在骨骼肌和肾中表达量极低。另外,与CEEB3L4 variant1相比,CEEB3L4 variant2普遍在组织中以极低的水平表达,说明CEEB3L4 variant1是组织中CEEB3L4存在的主要形式。4.为了研究CREB3的转录调控机制,我们克隆得到CREB3 5’端上游区域启动子区域1926bp,并进行转录因子结合位点分析,发现在GC box元件上游有4个SP1识别位点、1个NF-κ3位点、2个AP1位点和1个AP2位点。进而构建插入了此段区域的荧光素酶报告载体,检测到此段区域具有较强的启动子活性。5.用浓度为1μg/ml的脂多糖(LPS)分别刺激猪IBRS-2和小鼠RAW263.7细胞,使用qRT-PCR方法检测CREB3的表达变化。发现LPS刺激后,CREB3的表达量与对照相比无显著变化。另外,用同样浓度的LPS刺激共转后的293T细胞,检测启动子活性是否变化。结果与qRT-PCR一致,LPS刺激对CREB3启动子活性无显著性影响。