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几丁质酶是一类催化水解几丁质及其衍生物中的β-1,4糖苷键,产生N-乙酰胺基葡萄糖的糖基水解酶。几丁质被几丁质酶水解后,能产生多种不同聚合度的几丁寡糖。这些几丁寡糖具有多种生物活性,比如抗细菌和真菌活性,调控机体免疫能力及抗癌等功能。而且,几丁质酶能破坏植物寄生线虫肠道和病原真菌细胞壁中的几丁质成分。因此,几丁质酶在医药领域、环保领域和农林业中具有十分广泛的应用价值。本研究是针对实验室先前克隆的几丁质酶基因pachi,通过易错PCR技术构建pachi基因的随机突变库,采用96深孔板和T7噬菌体结合的高通量筛选技术,以1%可溶性壳聚糖为底物,DNS为指示剂,对随机突变库进行筛选。从大约12000个突变株中筛选到一株活性明显提高的突变体PachiN35D,与野生型进行氨基酸序列比对发现,突变体的第35位氨基酸残基由原来的天冬酰胺替换成天冬氨酸。比较分析野生型几丁质酶Pachi和突变体PachiN35D的酶学性质发现,对于可溶性壳聚糖底物,突变体PachiN35D的最适温度为50℃,比野生型Pachi的60℃下降了10℃。野生型Pachi在60℃水浴1 h后,还能保持76%的活性,而突变体PachiN35D在55℃水浴1 h后几乎完全丧失活性。分析野生型和突变体的动力学常数,野生型Pachi的Km是36.1 mg/mL,突变体PachiN35D的Km是13.3 mg/m L,突变体对于可溶性壳聚糖底物的亲和力提高了63%;野生型的kcat/Km值是0.37 mL/mg/min,而突变体的kcat/Km值是1.14 mL/mg/min,表明突变体PachiN35D的催化效率比野生型Pachi提高了2.1倍,并且突变体PachiN35D的比活力是49.9 U/mg,相比野生型Pachi的22.3 U/mg提高了1.2倍。将几丁质酶突变体用于秀丽隐杆线虫的生物测定,突变体的半致死浓度LC50为309.6μg/m L,比野生型的387.3μg/m L降低了20%,因此,突变体的杀线虫活性提高了20%。以纳米SiO2材料为载体,戊二醛为交联剂,采用共价交联法对几丁质酶突变体Pachi N35D进行固定化研究。通过傅里叶红外光谱仪和高倍电镜扫描分析固定化前后纳米SiO2材料的表征变化,检测到固定化后的纳米材料上几丁质酶上某些特征基团的波峰,且固定化后材料粒径不变,分布均匀,无明显聚集现象。固定化酶Im PachiN35D的固定化率高达98%,酶比活力保留率达到70%。比较固定化前后几丁质酶的酶学性质和动力学常数发现,固定化酶Im Pachi N35D的最适温度为55℃,相比未固定化Pachi N35D的50℃提高了5℃;在55℃水浴处理1 h后,突变体Pachi N35D几乎没有活性,而固定化酶Im PachiN35D仍保留了56%的活性。分析固定化前后酶的动力学参数发现,两者的Km,kcat,kcat/Km几乎没有变化,而固定化酶的比活力是未固定化酶的70%,可知固定化酶在提高了热稳定性的同时,还保留了固定化前几丁质酶的底物亲和力,催化效率以及大部分比活力。因此,纳米SiO2材料是几丁质酶固定化载体的最佳选择之一,本研究也为几丁质酶的广泛应用提供了新的思路和理论基础。