无核葡萄食用方便,品质优良,是鲜食葡萄和制干葡萄的主要类型。生产中栽培的无核品种属于种子败育型,受精胚珠在发育途中败育而不能形成正常的种子,在果实成熟时仅留下大小不同的种子痕迹。无核葡萄胚珠的败育在不同年份、不同地点具有高度的稳定性,不受外界环境条件的影响,主要由无核葡萄的自身遗传基因所决定,因而具有十分重要的研究利用价值。本研究以典型的无核品种‘无核白’败育前后胚珠为材料,构建cDNA文库,采用EST技术,并以文库为基础采用PCR技术克隆败育相关基因及其上游调控序列,以期获得无核葡萄败育相关的EST序列或基因;同时,分析有核葡萄‘京秀’和无核葡萄‘杨格尔’胚珠发育(败育)过程中活性氧的变化及其活性氧清除酶活性的变化,以揭示无核葡萄胚珠败育过程中活性氧代谢的变化趋势,探索无核葡萄胚珠发育过程中活性氧变化与种子败育的关系。研究主要取得如下结果:1、提取不同发育时期胚珠总RNA,构建cDNA文库通过控制授粉,以花后27d、30d、33d、36d、39d、42d、45d、48d的‘无核白’胚珠为材料,采用改良SDS法提取总RNA,构建了胚珠败育前后不同时间点混合的cDNA文库。原始文库滴度为5.87×105 pfu/ml,有效库容量为5.55×105 pfu,重组率达96.60%。插入片段主要分布在0.5-2.0kb之间,平均大小为900bp左右。扩增文库滴度为2.135×109 pfu/ml。2、文库的测序和EST分析通过随机测序,获得了214条质量好的EST序列。利用BlastN和BlastX程序将获得的214条序列与GenBank的nr数据库进行同源性分析,并将两种比较结果进行汇总,有144条序列与己知基因相似性很高,占67.29%;17条序列与功能尚未确定的假定蛋白或未知蛋白同源性很高,占7.94%;53条在nr数据库中未找到同源的序列,占24.77%。53条没有找到任何同源性的序列中,9条为葡萄新的EST序列。获得60个基因全长序列,文库中全长序列基因占有同源性基因161条的37.27%。其中167条EST在GenBank数据库的登陆号分别为EY254594、EY254595、EY254596、EY254922、EY254923、EY254924、EY254925、EY254926、EY254927、EY254928、EY254929、EY254930、EY254931、EY254932、EY254933、EY254934、EY254935、EY254936、EY254937、EY254938、EY254939、EY254940、EY254941、EY254942、EY254943、EY254944、EY254945、EY254946、EY254947、EY254948、EY254949、EY254950、EY254951、EY254952、EY254953、EY254954、EY254955、EY254956、EY254957、EY254958、EY254959、EY254960、EY254961、EY254962、EY254963、EY254964、EY254965、EY254966、EY254967、EY254968、EY254969、EY254970、EY254971、EY254972、EY254973、EY254974、EY254975、EY254976、EY254977、EY254978、EY254979、EY254980、EY254981、EY254982、EY254983、EY254984、EY254985、EY254986、EY254987、EY254988、EY254989、EY254990、EY254991、EY254992、EY254993、EY254994、EY254995、EY254996、EY254997、EY254998、EY254999、EY255000、EY255001、EY255002、EY255003、EY255004、EY255005、EY255006、EY255007、EY255008、EY255009、EY255010、EY255011、EY255012、EY255013、EY255014、EY255015、EY255016、EY255017、EY255018、EY255019、EY255020、EY255021、EY255022、EY255023、EY255024、EY255025、EY255026、EY255027、EY255028、EY255029、EY255030、EY255031、EY255032、EY255033、EY255034、EY255035、EY255036、EY255037、EY255038、EY255039、EY255040、EY255041、EY255042、EY255043、EY255044、EY255045、EY255046、EY255047、EY255048、EY255049、EY255050、EY255051、EY255052、EY255053、EY255054、EY255055、EY255056、EY255057、EY255058、EY255059、EY255060、EY255061、EY255062、EY255063、EY255064、EY255065、EY255066、EY255067、EY255068、EY255069、EY255070、EY255071、EY255072、EY255073、EY255074、EY255075、EY255076、EY255077、EY255078、EY255079、EY255080、EY255081、EY255082、EY255083、EY255084、EY255085。3、活性氧代谢相关基因的克隆以构建的cDNA文库库液为模板,以载体两端通用引物和设计的特异引物通过PCR法扩增、拼接,获得葡萄锰超氧化物歧化酶(VvMnSOD)和葡萄抗坏血酸过氧化物酶(VvAPX)基因。通过文库直接测序获得葡萄金属硫蛋白基因(VvMT)、葡萄硫氧还蛋白基因(VvTRX)、葡萄脱氢抗坏血酸还原酶(VvDHAR)共5个活性氧代谢相关基因全长cDNA序列,进一步利用生物信息学软件对其进行序列特征分析。葡萄金属硫蛋白基因(VvMT)的cDNA序列长540bp,含有一个240bp的完整的开放阅读框架(ORF),编码的蛋白含有14个高比例的半胱氨酸(Cys)残基,占总氨基酸数的17. 72%,具有C-x-C、C-x-y-C和C-C的序列结构,在GenBank的登陆号为EU280163。同时,高度保守的半胱氨酸富含区(cysteine rich region, CR区)分布在蛋白质的两端,具有典型MT基因结构的三段式特征。克隆的葡萄金属硫蛋白可以归Type 2,是MT家族的第15个成员。该基因的DNA序列长998bp,包含3个外显子和2个内含子,在GenBank的登陆号为EU280165;通过酶切、接头连接、巢式PCR,克隆了783bp的葡萄金属硫蛋白基因的上游调控序列。其核心启动子区域位于658～708bp之间,序列中TATA-box、A-box、CAAT-box、G-Box、ARE、Box-4、CCGTCC-box、GAG-motif、HSE、Skn-1_motif、TC-rich repeats、repeatscircadian等12个可能的启动子上游调控元件,其中Skn-1_motif是胚乳中特异表达的保守序列。葡萄硫氧还蛋白基因(VvTRX)的cDNA长561bp,开放阅读框架(ORF) 381bp,编码126个氨基酸,在氨基酸的13-117之间有Thioredoxin保守结构域,活性功能位点WCXP[C/S]保守性很强,VvTrx属于硫氧还蛋白基因h型的3亚类,在GenBank的登陆号为EU280164。以基因组DNA为模板,扩增VvTrx基因DNA序列长989bp,包含3个外显子和2个内含子,在GenBank的登陆号为EU280166。VvMnSOD基因cDNA全长896bp,完整的开放阅读框架(ORF) 687bp,编码228个氨基酸,序列的189～196之间含有Mn和Fe超氧化物酶的金属结合结构域DvWEHAYY,聚类分析表明为MnSOD,在GenBank的登陆号为EU280161;VvAPX基因cDNA全长1044bp,完整的开放阅读框(ORF)长度为762bp,编码253个氨基酸,序列的19～226具有peroxidase结构域,4～249之间具有ascorbate_peroxidase保守结构域,33～44之间含一个过氧化物酶的活性位点(Peroxidases active site signature)序列为APLMLRLAWHSA;其编码的蛋白属于胞质抗坏血酸过氧化物酶,在GenBank的登陆号为EU280159;脱氢抗坏血酸还原酶(VvDHAR)cDNA长990bp,完整的开放阅读框架(ORF)长639bp,编码212个氨基酸,预测位于细胞质,为1类DHAR,在GenBank的登陆号为EU280162。4、无核葡萄胚珠败育中蛋白质降解有关基因半胱氨酸蛋白酶及其抑制剂基因的克隆测序的VVTOV384的克隆3’端有poly(A)结构,5’端不完整。以文库菌液为模板,载体5端序列设计引物,采用半巢式PCR法进行5’RACE,克隆获得葡萄VvCysP基因,为木瓜蛋白酶型半胱氨酸蛋白酶,在GenBank的登陆号为EU280160,cDNA长1409bp,完整的开放阅读框架(ORF)长1134bp,编码377个氨基酸,是一个蛋白前体,成熟蛋白的长度可能为233个氨基酸残基,定位于细胞外。在氨基酸序列的163～174位点QGsCGSCWSfST为真核生物半胱氨酸蛋白酶的半胱氨酸活性位点,310～320位点LDHGVLLVGYG为真核生物半胱氨酸蛋白酶的组氨酸活性位点,334～353位点YWIiKNSWGENWGENGFYkI为真核生物半胱氨酸蛋白酶的天冬酰胺活性位点。半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因(VvCPI)的cDNA长872bp,开放阅读框759bp,编码252个氨基酸,5～125为半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因保守结构域CY,氨基酸序列的81～94位点EQVVAGKIYyLTLE为半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因(CYSTATIN)活性位点,1～22位为信号肽;为一个蛋白前体,成熟蛋白质属于细胞外蛋白。5、葡萄胚珠发育中活性氧和清除酶活性的变化以盛花后不同时期的无核葡萄品种杨格尔和有核葡萄品种京秀的胚珠为材料,测定胚珠中超氧阴离子( )和过氧化氢(H2O2)含量及活性氧清除酶活性的变化。结果表明:在两品种胚珠发育过程中均呈一直上升的趋势,在胚珠发育的中后期无核品种扬格尔产生速率明显大于有核品种京秀;胚珠中H2O2含量表现先升后降再升的趋势,但再升时无核品种扬格尔显著大于有核品种京秀;胚珠内活性氧清除酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(ASA-POD)及无核品种扬格尔的过氧化物酶(POD)表现先升后降的趋势,无核品种扬格尔的酶活性在胚珠败育后明显下降,有核品种京秀仍有较高的水平,且有核品种的POD活性先快速上升后一直保持缓慢上升的趋势。胚珠内活性氧类物质及活性氧清除酶类的变化趋势与无核葡萄杨格尔幼胚败育有一定的相关性。