背景： P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)作为一种由多药耐药性(Multidrug resistance,MDR)基因编码的能量依赖性药物外排泵,其通过脑内药物外排,降低脑内有效药物浓度,从而导致药物耐受现象的产生。抑制P-gp可以一定程度上达到预防或治疗药物耐受。近年来,P-gp已成为解决吗啡耐受发生或逆转的新靶点,其研究越来越引起广大研究者的关注。 我们前期采用免疫组化方法研究初步发现红霉素可逆转或拮抗P-gp介导的吗啡耐受效应,但其P-gp如何表达尚不明确,无法探讨红霉素逆转吗啡耐受的作用机制；另外吗啡耐受大鼠脑组织不同区域P-gp表达亦存在一定的差异,因此了解不同脑区在大鼠慢性吗啡耐受形成过程的作用极为重要。根据研究方法和部位的不同,将本项研究分为两部分。 第一部分 红霉素逆转慢性吗啡耐受对大鼠脑内P-糖蛋白表达的影响 目的： 研究红霉素逆转慢性吗啡耐受对大鼠脑内P-gp表达的影响,在此基础上探讨红霉素逆转吗啡耐受的机制。 方法： 雄性SD大鼠18只,体重250-280g,大鼠随机分为三组(n=6):A组(慢性吗啡耐受组)、B组(红霉素逆转吗啡耐受组)和C组(生理盐水对照组)。参照Mao等报道的方法,A组和B组每天以吗啡10 mg/kg进行皮下注射两次,分别在8AM和6PM,连续7天；C组皮下注射10 ml/kg的生理盐水作为空白对照。同时A组：在注射吗啡30 min后腹腔注射10 ml/kg的生理盐水；B组：在注射吗啡30 min后腹腔注射75 mg/kg的红霉素；C组：在注射生理盐水30 min后腹腔注射10 ml/kg的生理盐水。通过光辐射热甩尾法测大鼠出现甩尾反应的潜伏期(Tail-flick latency,TFL阈值),以确定吗啡耐受的形成和吗啡耐受程度的变化,数据表示为最大镇痛百分率(MPE％=[(给药后痛阈-给药前痛阈)/(15-给药前痛阈)]*100％)。模型建立成功后取大鼠新鲜大脑组织,通过蛋白质免疫印记(Western blot)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析比较各组大鼠之间大脑组织中P-gp的表达情况。 结果： 1、三组模型建立过程中疼痛学行为变化A组与C组相比,第一天的MPE％为(100±0)％,第三天和第五天分别下降到(80±26)％和(60±28)％,第七天下降到(23±17)％,表明吗啡的镇痛效果下降,提示吗啡耐受已经形成；B组第一天MPE％为(100±0)％,第三天和第五天分别下降到(91±13)％和(65±8)％,第七天为(57±11)％,呈现下降趋势,但在各时间点的MPE％值均比A组各值超过30％,表明吗啡的镇痛效果也有一定程度的下降,但红霉素能够部分延缓或逆转吗啡耐受的形成；而C组第一天的MPE％为(1±7)％,第三天和第五天分别下降到(3±8)％和(1±5)％,第七天为(0±6)％。 2、Western blot检测情况A组和B组中P-gp相对值分别为(1.50±0.11)和(1.56±0.10),组间比较无统计学差异(P>0.05),但两组较C组脑内P-gp相对值(0.32±0.05)明显升高(P<0.05)。 3、RT-PCR检测情况A组和B组中P-gp mRNA相对值分别为(2.46±0.22)和(2.69±0.17),组间比较无统计学差异(P>0.05),但两组较C组脑内P-gp mRNA相对值(0.50±0.09)明显升高(P<0.05)。 结论： 红霉素作为P-gp的逆转剂,并不会降低慢性吗啡耐受大鼠脑内P-gp表达量,其作用机制可能是通过与吗啡竞争性抑制P-gp上的结合位点,减少P-gp由脑组织排出吗啡的量,增加脑组织内游离吗啡浓度而生效。 第二部分慢性吗啡耐受大鼠不同脑区中P-糖蛋白差异表达的研究 目的： 研究慢性吗啡耐受大鼠脑内额叶皮层、海马及下丘脑的P-gp差异表达情况,探讨不同脑区在大鼠慢性吗啡耐受形成过程中的作用。 方法： 采取与第一部分相同的方法建立动物模型,取大鼠大脑(去除脑干和小脑部分)后,按Paxinos & Watson鼠脑定位图谱,低温处理后分别取出额叶皮层、海马和下丘脑区脑组织,通过RT-PCR比较不同脑区P-gp mRNA的表达情况。 结果： 1、连续7天注射吗啡后,模型成功建立。 2、A组、B组和C组三组之间额叶区P-gp mRNA相对值分别为(0.48±0.12)、(0.62±0.15)和(0.56±0.21),组间比较无统计学差异(P>0.05)。 3、A组海马区和下丘脑区中P-gp mRNA相对值分别为(2.12±0.31)和(2.41±0.25),均明显高于A组额叶区P-gpmRNA相对值(0.48±0.12)(P<0.05);B组海马区和下丘脑区中P-gp mRNA相对值分别为(2.34±0.23)和(2.52±0.19),均明显高于B组额叶区P-gp mRNA相对值(0.62±0.15)(P<0.05);C组三个脑区之间P-gp mRNA相对值分别为(0.56±0.21)、(0.41±0.13)和(0.43+0.25),组间比较无统计学差异(P>0.05)。 结论： 慢性吗啡耐受大鼠不同脑区P-gp存在表达差异,其中海马和下丘脑P-gp表达明显高于额叶皮层,理论上这将可能导致吗啡应用后脑内不同脑区的吗啡浓度存在差异。慢性吗啡耐受大鼠不同脑区中P-gp表达存在差异可能是不同脑区在慢性吗啡耐受形成过程中作用和地位差异的主要原因之一。