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第一部分MCMV感染导致听力损失的发病机制研究【目的】建立小鼠巨细胞病毒（MCMV）感染导致听力损失的小鼠动物模型，研究高迁移率族蛋白B1（HMGB-1）细胞信号通路在其发病机制中的作用。【方法】体外细胞培养法制备MCMV Smith株，细胞病变法（CPE）测定病毒致半数细胞感染量（TCID50）。ELISA法筛选MCMV IgM、IgG均阴性的BALB/c小鼠，雌雄小鼠交配受孕，待分娩后随机选择乳鼠分为病毒感染组和实验对照组，于生后24h内颅内注射病毒悬液100TCID50/10μL和等量无菌生理盐水。观察各组幼鼠的生存发育情况；测定2周龄幼鼠的听性脑干反应（ABR）；取幼鼠内耳组织分别采用RT-PCR和Western Blot法检测MCMV和HMGB-1 mRNA、糖基化终产物受体（RAGE）和NF-κB抑制物（IκBα）蛋白的表达。【结果】MCMV TCID50为105.22/0.1mL。病毒感染组幼鼠存活44/121只，存在明显生长发育异常；实验对照组幼鼠存活47/47只，无显著异常。ABR测定听阈显示病毒感染组为28.42±3.03 dB，实验对照组为15.66±0.38 dB，差异有非常显著意义（P<0.01）。病毒感染组MCMV mRNA检测阳性，实验对照组阴性；HMGB-1 mRNA病毒感染组显著高于实验对照组（P<0.05）；病毒感染组RAGE蛋白表达较实验对照组明显升高，而IκBα明显降低，差异均有非常显著意义（P<0.01）。【结论】成功建立了MCMV感染导致听力损失的动物模型；HMGB-1/RAGE/NF-κB通路可能在CMV感染导致的听力障碍发病机制中占据重要地位。第二部分pshHMGB-1-EGFP双基因载体的构建和体外表达【目的】构建HMGB-1短发夹状RNA（shRNA）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的双基因真核表达载体，并转染NIH/3T3细胞，以筛选出最有效的干扰质粒用于宫内基因治疗（IUGT）活体实验。【方法】设计并合成5种DNA寡核苷酸双链，分别含有被9bp茎环（loop）序列间隔的4个HMGB-1基因片段的反向重复序列以及阴性对照序列NC，与携带EGFP基因的pGenesil-1质粒载体连接，构建重组质粒pshHMGB-1-EGFP a、b、c、d和阴性对照质粒pNC-EGFP。对重组质粒酶切鉴定和测序后采用脂质体转染法转染NIH/3T3细胞，采用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效率，RT-PCR和Western Blot测定HMGB-1mRNA和蛋白水平。【结果】Sal I酶切鉴定和测序结果表明重组质粒构建正确；在荧光显微镜下可以观察到NIH/3T3细胞内的绿色荧光，流式细胞技术检测转染率达57.25％；分别转染重组质粒pshHMGB-1-EGFP a、b、d的3组细胞HMGB-1 mRNA水平均呈不同程度下降，以质粒d最为明显，与其余各组差异具有显著意义（P<0.05）；转染重组质粒pshHMGB-1-EGFP a、b、d的3组细胞HMGB-1蛋白水平均降低，以d最为明显，与转染阴性对照质粒NC组和空白细胞组的差异具有非常显著意义（P<0.01）。【结论】成功构建了pshHMGB-1-EGFP双基因真核表达载体；重组干扰质粒能有效转染NIH/3T3细胞，并产生RNAi效应抑制HMGB-1表达，为RNAi用于IUGT的动物实验奠定了基础。第三部分pshHMGB-1-EGFP用于宫内基因治疗的初步研究【目的】观察pshHMGB-1-EGFP重组质粒通过胎盘转染胎儿的效率和胎儿体内的RNAi效应，探索RNAi联合IUGT治疗先天性疾病的可能性。【方法】将孕12.5d BALB/c小鼠随机分为4组：pshHMGB-1-EGFP＋脂质体组（1组），pNC-EGFP＋脂质体组（2组），pNC-EGFP组（3组），生理盐水组（4组）。分别经尾静脉注射DNA-脂质体复合物（或质粒DNA或无菌生理盐水）。72h后处死孕鼠，分离胎盘和胎鼠各脏器，荧光显微镜检测胎盘和胎鼠体内EGFP表达；RT-PCR检测胎鼠HMGB-1 mRNA水平；电泳迁移率改变分析（EMSA）测定胎鼠NF-κB活性。【结果】借助脂质体转染的1、2组孕鼠所有胎仔体内均可见绿色荧光，单纯质粒注射的3组孕鼠所产41只胎仔均未检出荧光。1、2组胎盘绒毛膜板和迷路区、胚胎肝、肾、脑组织局部尤其脑室、心肌纤维之间小血管、大血管壁、肺间质血管壁、脾皮质及髓质血窦均可见较强烈绿色荧光表达，3、4组相应区域荧光表达微弱或未见明显荧光。1组HMGB-1 mRNA较其余3组明显降低，差异有显著意义（P<0.05）；NF-κB活性较其余3组明显降低，差异有非常显著意义（P<0.01）。【结论】pshHMGB-1-EGFP能在脂质体辅助下通过胎盘转染胎仔，并在胎仔体内发挥RNAi效应抑制HMGB-1表达和NF-κB活性，为CMV宫内感染导致的先天性疾病提示了一条可能的治疗途径。