临床新城疫病毒分离鉴定及F蛋白单克隆抗体的研制与应用

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新城疫(Newcastle disease,ND)是威胁养禽业发展的一种重要传染病,给养禽业造成巨大经济损失,OIE将其与高致病性禽流感一起列为危害养禽业必须报告的疫病,该病在我国时有发生。自1997年以来,新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)不仅感染鸡,而且还感染鹅。虽然各地采取了积极的防治措施,但该病仍然蔓延、流行。有不少学者对此进行了研究,但有关病原的生物学特性及流行病学等方面仍存在很多疑问。   本研究从临床采集30例疑似新城疫病死鸡脑、肝等组织和从自然保护区采集3例野鸭棉拭子,通过SPF鸡胚接种分离病毒,并对分离获得的病毒进行了鉴定。结果表明,分离获得的19株病毒有血凝性,经HA、HI以及IFA试验验证,其中18株为NDV。应用RT-PCR方法对分离株NDV的融合蛋白F基因和血凝素神经氨酸酶HN基因进行扩增,序列分析结果表明,分离株DTC-050508和三株野鸭源NDV在第112、115位是碱性氨基酸,第117位是F(Phe)具有NDV强毒的特征,DTC-050408在第112、115位是中性氨基酸,第117位是L(Leu)具有NDV弱毒的特征。进一步分析表明,野鸭源NDV与鹅源NDV在基因序列有很高的同源性。   对野鸭源NDV分离株JS0601/wd的全基因组进行了序列分析,结果表明,该病毒全基因组长15192bp,与GenBank上已发表的ZJ1、NA-1、SF02、IT-227、ITdove等毒株基因组全长相同,各编码蛋白基因位置基本一致,说明NDV病毒基因组结构在不同宿主遗传进化上具有保守性。JS0601/wd基因组编码的NP、P、M、F、HN和L蛋白的长度与分离株ZJ1、NA-1、SF02等完全一致,与我国近年来流行于鹅的NDV同源性高达97%以上,说明他们可能有相同的来源和遗传进化关系,为我国NDV流行病学研究和控制提供了重要资料。   在用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统成功表达了NDV标准强毒株F48E8株F基因的基础上,利用表达的重组蛋白免疫小鼠,通过间接免疫荧光筛选杂交瘤细胞,结果获得了12株抗NDVF蛋白单克隆抗体,分别命名为1B4、4B11、5F3、4C1、2H10、6F8、4H10、1D10、2F12、4D9、5C6、6C4。血凝和血凝抑制试验表明,所有单抗均无血凝抑制特性;中和试验结果证明,单抗4D9具有很好的中和能力,6C4、2F12有一定程度的中和效价,其他单抗没有明显的中和作用;尽管在IFA试验中,不同单抗与不同动物来源的NDV表现出不同的免疫反应性和反应谱,但在Western blot试验中,所有单抗均能识别不同来源NDV的F蛋白,这些单抗为NDV的深入研究提供了高质量试剂材料。   为了解决临床上ND的快速诊断问题,本研究以研制的单抗为核心试剂,建立了间接免疫荧光技术快速检测NDV的方法。研究结果表明,该方法特异性强,与试验的其他病毒如传染性法氏囊病毒、马立克氏病毒及小鹅瘟病毒等均不出现交叉反应,仅与NDV感染的CEF反应,该方法可以在18h检测出NDV,显示出很好的应用前景,为ND防控创造了新方法。
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