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系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种涉及多基因、多系统和多器官受累的自身免疫病,严重威胁了人类健康。SLE的发病机制非常复杂,一般认为与遗传、激素和环境相关。尽管其发病机制仍不十分明确,但近年来的研究认为,SLE患者T、B淋巴细胞免疫紊乱导致致病性的自身抗体大量产生,形成的免疫复合物沉积在皮肤、关节、大脑和肾脏等器官或组织,是造成疾病甚至死亡的主要原因。由于B淋巴细胞是机体产生大量病理性自身抗体的主要细胞,并且参与SLE复杂的免疫过程,因此以B细胞的靶向治疗成为研究热点。B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator, BLyS),也称B细胞活化因子(B-cell activating factor, BAFF),是1999年发现的肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor,TNF)超家族新成员,主要由单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞分泌产生。BLyS通过与其相应受体结合发挥其调控B淋巴细胞成熟、促进免疫球蛋白类别转换、辅助T细胞活化和参与自身免疫等作用。已有文献报道,在SLE患者和具有狼疮倾向的模型动物血清中BLyS水平显著升高,降低BLyS水平可改善病情或模型症状。2011年,针对BLyS开发的治疗SLE的单克隆抗体药物(Belimumab)成为50多年来美国FDA批准上市的唯一一个新药。虽然围绕BLyS国内外开展了很多研究,但对于BLyS促进B细胞向浆细胞转化的机制尚不清楚,有待深入研究。跨膜激活、钙调和亲环素配基相互作用因子(Transmembrane activator-1 and calcium modulator and cyclophilin ligand-interactor, TACI)是BLyS的三个受体之一。以生物工程技术研制的TACI受体融合蛋白(TACI-Ig),作为BLyS的一种诱骗受体,可与体内BLyS结合,降低SLE病人或模型动物体内高水平的BLyS。课题研究发现,TACI-Ig注射给药可明显减少红斑狼疮模型小鼠MRL/lpr的蛋白尿产生,小鼠脾脏和淋巴结体积缩小,B淋巴细胞显著减少,生发中心形成障碍,对SLE模型小鼠具有较好的治疗作用。在此基础上,进一步探讨了BLyS促进B细胞向浆细胞转化和抗体产生的分子机制,研究了BLyS对B淋巴细胞和滤泡辅助T淋巴细胞(T follicular helper cells, Tfh)表型和功能的影响,同时观察了TACI-Ig的作用,为进一步阐明BLyS参与SLE的B细胞活化和向浆细胞转化的分子机制以及以BLyS及其信号为靶点的新药作用机制提供实验依据。目的：观察TACI-Ig对自发性狼疮样模型小鼠MRL/lpr的治疗作用,从病理形态学、免疫学及细胞分子信号等方面,研究BLyS在MRL/lpr小鼠B淋巴细胞向浆细胞转化中的作用；观察BLyS体外对B细胞成熟、转化和Tfh细胞功能的作用,进一步阐明BLyS参与SLE的B细胞转化和Tih细胞活化的分子机制,深入探讨TACI-Ig的药理作用机制,为临床治疗SLE提供实验依据。方法：1.体内实验部分：将MRL/lpr小鼠随机分为模型组、ACI-Ig(3.75,7.5,15mg/kg,皮下注射给药)组和阳性对照组(强的松,prednisone,5mg/kg,灌胃给药),另设BALB/c小鼠为空白对照组。观察并记录动物给药8周的行为活动、毛发状态、关节肿胀等体征异常变化,用目测尿蛋白试纸检测动物的尿蛋白变化,HE染色法检查动物的肾脏和脾脏病理变化,ELISA法检测小鼠血清中免疫球蛋白(IgG1、 IgG2a)、抗核抗体(anti-nuclear antibody, ANA)、抗双链DNA抗体(anti-dsDNA)、 BLyS、白细胞介素10 (interleukin 10,IL-10)和IL-21水平,流式细胞术检测脾脏T、B淋巴细胞亚群,Western blot检测脾脏B淋巴细胞诱导成熟蛋白-1(B-lymphocyte induced maturation protein-1, Blimp-1)和B细胞淋巴瘤-6(B-cell Lymphoma-6, Bcl-6)蛋白表达。2.体外实验部分：MTT法检测BLyS不同浓度和不同时间对MRL/lpr小鼠脾淋巴细胞增殖的影响,以确定重组BLyS体外用药的刺激浓度和时间；流式细胞术检测BLyS受体在Tfh细胞表面的表达及TACI-Ig体外给药对重组BLyS诱导的MRL/lpr小鼠脾脏T、B细胞亚群比例的影响；ELISA法检测IL-21和IgG水平；Western blot、 RT-qPCR法分别检测Tfh细胞的Bcl-6蛋白和基因表达水平。结果：1. TACI-Ig皮下注射给药对MRL/lpr小鼠的治疗作用TACI-Ig (7.5,15mg/kg)皮下注射给药可明显降低模型小鼠的尿蛋白水平,有效改善毛发脱落,降低小鼠的损伤指数；能显著改善模型小鼠的肾脏肾小球系膜细胞增生、炎性细胞浸润等病变,明显抑制脾脏增生肿大和生发中心形成等病理变化,显著降低小鼠升高的脾脏指数。结果提示,TACI-Ig (7.5,15mg/kg)皮下注射给药可改善模型小鼠的狼疮性肾炎和脾脏肿大等特征性病理变化,提示TACI-Ig对MRL/lpr小鼠有明显治疗作用。2. TACI-Ig皮下注射给药对MRL/lpr小鼠免疫相关指标的影响TACI-Ig (7.5,15mg/kg)可明显降低模型小鼠血清中升高的BLyS、IgG1、ANA、 anti-dsDNA、IL-10和IL-21水平,对ANA和BLyS水平的降低具有剂量依赖性。结果提示,TACI-Ig作为诱骗受体与体内高水平的BLyS结合,降低了体内游离的BLyS水平,显著减少了自身抗体的产生和致炎因子水平。进一步研究发现,TACI-Ig (7.5,15mg/kg)可显著降低脾脏总B淋巴细胞(CD19+)、成熟B淋巴细胞(CD19+IgD+)、脾脏边缘区B细胞(CD19+CD21+)、滤泡区B细胞(CD19+CD23+)的比例和浆细胞(CD19-CD138+)数量,同时降低了Tfh细胞(CD4+PD1+CXCR5+)以及表达活化诱导分子Th细胞(CD4+CD69+)的比例。TACI-Ig (7.5,15mg/kg)还可降低脾脏组织Blimp-1和Bcl-6的蛋白表达水平。以上结果提示,TACI-Ig给药可调节MRL/lpr小鼠T、B淋巴细胞亚群比例,抑制自身抗体产生,降低致炎细胞因子和转录因子Blimp-1和Bcl-6表达水平,其作用可能与降低体内BLyS水平有关。3. BLyS促进浆细胞分化及TACI-Ig的作用体外给予BLyS (1μg/ml) 48h,可显著升高MRL/lpr小鼠脾脏总B淋巴细胞(CD19+)、成熟B淋巴细胞(CD19+IgD+)和浆细胞(CD19-CD138+)数量,升高细胞上清中IgGl水平。TACI-Ig (1.0, 10.0μg/ml)可抑制B淋巴细胞的活化,降低BLyS诱导升高的总B细胞、成熟B细胞及浆细胞数量,减少IgG抗体分泌,而对记忆B细胞和IgM水平无明显影响。结果提示,BLyS可促进B淋巴细胞活化,可能在促进B淋巴细胞向浆细胞转化和抗体产生中发挥重要作用。4. BLyS对T淋巴细胞亚群和功能的影响及TACI-Ig的作用BLyS (1μg/ml)体外给药48h,可显著升高MRL/lpr小鼠脾脏Tfh细胞(CD4+PD1+CXCR5+)、表达活化诱导分子Th细胞(CD4+CD69+)的比例,促进IL-21产生。TACI-Ig (1.0,10.0μg/ml)可降低上述T细胞亚群比例和IL-21水平。结果提示,BLyS可促进T细胞的活化和Tfh细胞的激活,促进炎症因子分泌,进一步加剧了T-B细胞免疫反应异常。5. BLyS对Tfh细胞增殖和产生细胞因子的影响及TACI-Ig的作用Tflh细胞是主要辅助B细胞转化的T细胞亚群,Tfh细胞的CD40L与诱导共刺激分子(induced co-stimulator, ICOS)分别通过与B细胞上CD40和ICOSL结合,以及Tfh细胞分泌的IL-21,在刺激B细胞的增殖、分化以及免疫球蛋白类别转换中发挥重要作用。研究发现,MRL/lpr小鼠Tfh细胞表面高表达BLyS受体BR3和BCMA, TACI表达较少。BLyS 1μg/ml)体外给药48h,可显著促进MRL/lpr小鼠脾脏Tfh细胞增殖和IL-21的产生,TACI-Ig (1.0,10.0μg/ml)可抑制BLyS诱导的MRL/lpr小鼠Tfh细胞增殖,降低升高的IL-21水平。结果提示,BLyS可能通过与Tfh细胞上BR-3和BCMA结合,促进Tfh细胞的增殖和IL-21的分泌,促进了B淋巴细胞的活化和浆细胞的形成。Tfh细胞可能在BLyS诱导B细胞向浆细胞分化中发挥辅助作用。6. BLyS对Tfh细胞转录因子Bcl-6的影响及TACI-Ig的作用Bcl-6是Tfh细胞发育和生发中心形成的关键分子,在Tfh细胞促进B淋巴细胞向浆细胞转化中起重要作用。BLyS (1μg/ml)体外给药48h,可明显提高MRL/lpr小鼠脾脏Tfh细胞Bcl-6的基因表达和蛋白水平,TACI-Ig可降低BLyS刺激的MRL/lpr小鼠脾脏Tfh细胞Bcl-6表达。结果提示,BLyS上调Tfh细胞Bcl-6的表达可能是其促进B细胞向浆细胞分化的重要分子机制。结论：1. TACI-Ig (7.5,15mg/kg)给药可改善MRL/lpr红斑狼疮小鼠模型小鼠肾脏和脾脏病理,抑制自身抗体和炎性细胞因子产生,调节免疫细胞亚群,具有明显的治疗作用。2.首次发现了BR3和BCMA受体在Tfh细胞上的表达,证实了BLyS可通过与细胞表面受体结合促进MRL/lpr小鼠Tfh细胞的增殖和IL-21产生。这可能是BLyS促进B细胞向浆细胞分化的重要机制之一3. BLyS诱导Tfh细胞转录因子Bcl-6表达,进一步加剧B淋巴细胞向浆细胞转化和生发中心形成,可能是SLE产生高水平自身抗体的重要机制。4. TACI-Ig给药可显著降低MRL/lpr小鼠体内BLyS水平,抑制脾脏B淋巴细胞的成熟活化,调控Tfh细胞功能,可能是其发挥治疗作用的机制。