目的:　　 肾脏在实现其生理功能的长期进化中,经过发生发育形成了空间排列精致的微细结构,包括皮髓质中两种肾单位的分布、肾小管不同节段的分布、肾小管和集合管以及肾小管和血管伴行关系等。文献表明,肾脏在发生发育过程中的缺陷在成年将以某种疾病形式显示出来,而对肾微细结构演变规律的研究一直受技术手段的限制,鲜见详细系统的研究报道。探索发生发育中小鼠肾单位形态演变的时空性、结构之间的毗邻关系,为阐明肾发生发育的分子生物学机制,以及肾生理及病理学研究提供形态学依据。　　 肾脏发生发育重演了种系发生中的进化现象,经历了无功能期的前肾、具有临时泌尿功能的中肾,和功能性的后肾三个阶段,后肾发育成永久肾。肾单位起源于后肾间充质,在输尿管芽的诱导下,后肾间充质细胞分化形成肾单位。肾单位的形态发生经历了间充质细胞积聚、上皮样结构的囊泡期、逗号小体期、S小体期、肾小体和肾小管节段的分化发育,以及与集合管系的融合。　　 本研究利用前期建立起来的三维重建技术,以胚胎第17天(E17d)小鼠肾组织连续切片形成的系列配准显微图像为基础,追踪肾单位肾小管的走行,建立其走行的坐标数据库,并使其走行可视化,进而进行结构空间走行及毗邻关系的分析。　　 实验方法:　　 1、实验动物　　 选取25～30g成年健康昆明小鼠,雌、雄(2:1)同窝饲养,每日早8时、中午12时、晚6时三次观察受孕情况,以观察到雌鼠阴道栓的最早时间计为胚龄0天(E0d)。　　 2、树脂包埋连续切片的制备　　 取孕龄17天孕鼠,2.5%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉后,剖腹取出胎鼠,打开胎鼠腹腔取双侧肾脏,4%多聚甲醛与1%戊二醛混合固定液浸泡固定24小时,经肾门,与肾长轴垂直截切肾脏组织块,入同种固定液续固定48h,PBS冲洗,锇酸后固定,各级乙醇至丙酮脱水,丙酮与环氧树脂EP812混合液浸透,单纯树脂EP812包埋。采用超薄切片机配钻石刀连续半薄切片(2.5μm厚),所有切片进行甲苯胺蓝染色以显示组织形态结构,用于肾单位三维重建。　　 3、显微图像获取与配准　　 应用“计算机-显微镜-数码相机”图像采集系统(OlympusAX70显微镜:OlympusDP50相机,东京,日本),对E17d的连续切片进行显微镜下拍照。图像大小为2596×1889像素,每个像素相当于1.83μm×1.83μm。图像配准过程在计算机Windows平台上操作。其原理是,通过比较相邻两幅图像内生理对应点的像素灰度值的相似性来确定每个图像平移及旋转,使其达到生理空间的一致[雪4,5]。首先得出相邻两幅图的相对变换值(平移距离和旋转角度),再通过求相对变换值的相加函数得出系列图像中的每幅图的绝对变换值,从而实现图像配准。　　 4、数字追踪与三维分析　　 对E17d小鼠肾单位肾小管进行数字追踪,追踪是通过C语言设计的程序在计算机Linux平台上实现的。泌尿小管的追踪始于肾门处的输尿管芽,截止至与肾单位的连接处。血管的追踪始于肾小体血管极的出球微动脉。追踪过程自动生成一个数据文件,记录追踪肾小管走行的空间坐标,基于此坐标集,肾小管走行的毗邻关系分析,以及肾小管长度测量等得以实现。小管长度的测量运用欧几里德算法,即累加沿近端小管或出球微动脉走行的每两个连续点的距离,得出沿近端小管或出球微动脉走行任意两点之间的距离。X∑I-2√(xi-xi-1)2+(yi-yi-1)2+(zi-zi-1)2　　 实验结果:　　 对E17d小鼠连续组织切片的形态学分析显示,E17d小鼠肾脏可清楚的区分为周围的皮质和中央的髓质。肾脏被膜下的生肾区可见输尿管芽未端分支大泡的各种断面,其周围是密集的基质细胞,并可见由基质细胞形成的囊泡体、逗号小体和S小体,其内侧可见Ⅲ期肾小体,而最内侧近髓质的皮质区分布为Ⅳ期肾小体及围绕其周围的自身近端小管和远端小管,此时,髓放线并不明显,可见输尿管芽穿过皮质区到达肾被膜下,并形成对称的分支泡。髓质内可见稀疏排列的、梯状的间充质及与其垂直排列的、成束的输尿管芽,以及走行在其周围的发育中的髓襻,肾乳头已开始形成。　　 对E17d小鼠肾单位进行数字追踪表明,输尿管芽在此期已有6级以上的二杈分支,分支的对称性并不贯穿全程。最后以及分支末端形成大泡,每侧连接2个以上的肾单位,它们中常常有一个逗号小体或S形小体。较成熟的肾单位髓襻深入髓质,并常常与输尿管芽伴行,同时,近髓质的肾单位的出球微动脉常攀附髓襻升支粗段走行,而髓襻降支周围常常被发育中的血管丛包绕。　　 结论:　　 1、输尿管芽在E17d已有6级以上的二杈分支,分支的对称性并不贯穿全程。最后一级分支末端形成大泡,每侧连接2个以上的肾单位,它们中常常有一个逗号小体或S形小体。　　 2、近髓质的肾单位的出球微动脉常攀附髓襻升支粗段走行,而髓襻降支周围常常被发育中的血管丛包绕。