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背景:泌尿生殖系统感染和免疫因素约占所有男性不育病例的13-15%。睾丸是免疫豁免器官,需要耐受生殖细胞的自身抗原,即使在感染或炎症条件下也能保持免疫稳态。睾丸巨噬细胞（TM）在维持睾丸免疫豁免和保护精子发生中起着核心作用。最近的研究表明,睾丸间质液中的皮质酮在维持TM功能和表型中发挥重要作用,但其潜在的分子机制尚不清楚。巨噬细胞经常被分为经典激活的促炎巨噬细胞（M1）和选择性激活的抗炎巨噬细胞（M2）。细胞能量代谢途径与其功能存在重要的直接联系,例如:M1和M2巨噬细胞分别依赖糖酵解和氧化磷酸化途径维持其特定的表型和功能。此外,这些代谢途径之间的转换也可以诱导巨噬细胞表型和功能的改变。皮质酮能否通过调控巨噬细胞代谢途径从而改变其表型并在细菌性睾丸过程中发挥作用有待于继续研究。因此,本课题旨在研究皮质酮对巨噬细胞代谢途径、表型和功能的影响,探讨调节和维持小鼠TM抗炎表型的途径,并为睾丸炎患者创新疗法的开发开辟一条的新的途径。方法:1.TM、腹腔巨噬细胞（PM）和骨髓源性巨噬细胞（BMDM）的分离培养将从生精小管、腹腔、骨髓中得到的细胞经过离心、裂红、贴壁、洗涤等步骤得到对应的巨噬细胞,TM、PM于RPMI 1640完全培养基中,BMDM于RPMI 1640+巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）（50ng/ml）的完全培养基中,37℃,5%CO2 培养。2.Western blotRIPA裂解液提取蛋白并测量蛋白浓度后,每个样品上样20μg蛋白跑胶并转移到硝化纤维素膜上。5%脱脂牛奶孵育1h后与p-AMPK、AMPK、pACC1、ACADM、ACADVL等一抗4℃孵育过夜。洗膜后与对应种属二抗室温结合1小时,TBST洗涤三次后ECL显影。3.PCRTrizol提取细胞总RNA,2μg总RNA逆转录为cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix在ABI PRISM 7300HT序列检测系统上进行qRT PCR,检测脂肪酸代谢相关基因表达。4.Seahorse XF96 分析将TM、PM或皮质酮刺激的BMDM接种在海马培养板上的分析培养基中,并使用海马XFe-96系统进行分析,测量ECAR和OCR。5.流式细胞术（FACS）采用FACS测定TM和皮质酮刺激BMDM中的巨噬细胞标记物水平。将细胞与目标抗体4℃,无光条件下孵育30min,洗涤并重新悬浮在洗涤缓冲液中。使用FACS AriaⅡ进行流式细胞术分析。6.ELISA使用TNF-α和IL-10 ELISA试剂盒检测TM、PM及BMDM培养基中TNF-α和IL-10蛋白的浓度。7.UPEC睾丸炎模型建立在全身麻醉后,切开下腹以暴露输精管。使用30 G针将10μl UPEC菌株生理盐水（约5×105个细菌）悬浮液双侧注射到靠近附睾尾端的输精管中。注射前在注射部位附近结扎,以防止感染顺行向尿道扩散。8.皮质酮治疗睾丸炎模型从术后第二天开始,给动物腹腔注射皮质酮（0.1mg/天）±AMPK抑制剂Compound C（0.4mg/kg）。将小鼠标准饲养条件下饲养,直到手术后第7天处死。9.H＆E染色收集UPEC诱发的睾丸炎睾丸,并在固定液中固定4小时,然后石蜡包埋。切片后用苏木精和伊红染色。结果:1.皮质酮诱导BMDM向M2表型极化:皮质酮刺激的BMDM超过50%巨噬细胞表达M2标记蛋白CD206。Cd206及抗炎细胞因子Il10的mRNA在皮质酮处理组表达显著升高,同时促炎细胞因子基因Tnfa的表达降低。此外,皮质酮刺激提高BMDM的OCR水平。2.皮质酮激活AMPK并增强BMDM中的脂肪酸代谢:在皮质酮刺激后,p-AMPK显著激活。BMDM的皮质酮刺激显著增加了 FAO关键酶p-ACC、ACADM、ACADVL的表达。此外,脂肪酸代谢相关基因:Cpt1、Acc1、Acadm、Fasn 的 mRNA水平也有所上调。3.AMPK抑制剂减弱BMDM和TM中M2表型:Compound C刺激逆转了BMDM中皮质酮介导的AMPK激活。Compound C刺激显著降低皮质酮刺激BMDM中的OCR水平,并显著抑制FAO相关基因Acc1、Cpt1和Acadm的表达;Compound C刺激下调BMDM中CD206的蛋白和基因水平表达。并降低了 TM中p-AMPK的激活,以及OCR水平。4.皮质酮刺激的BMDM和TM依赖AMPK介导抗炎细胞因子的产生:抗炎细胞因子Il10基因表达在LPS处理后1h和3h显著增加,并被Compound C抑制。在蛋白质水平,LPS刺激后3小时BMDM中TNF-α蛋白表达增多,Compound C进一步增强TNF-α表达,IL-10蛋白水平与基因水平变化一致。LPS刺激下,TM IL-10蛋白表达及基因表达水平显著升高,Compound C刺激逆转了 IL-10的分泌。5.皮质酮治疗改善UPEC诱发的睾丸炎:UPEC感染导致睾丸中F4/80hi常驻TM和CD1 1bhi单核细胞衍生巨噬细胞的百分比和数量显著升高,用皮质酮治疗后,这些增加明显减少。Compound C处理后可回调皮质酮对于巨噬细胞募集的抑制效果。皮质酮治疗恢复了 UPEC介导的CD206+群体的占比降低,而Compound C减弱皮质酮治疗效果。皮质酮治疗组的TM中,Tnfa表达下调,Acadm表达上调,这种效应被Compound C的加入逆转。H＆E染色中,感染UPEC并接受皮质酮治疗的小鼠生精小管中生殖细胞缺失严重程度较未治疗组轻。同样皮质酮的作用被Compound C治疗部分逆转。结论:皮质酮通过激活AMPK介导的FAO诱导BMDM向M2表型分化。此外,皮质酮治疗可通过该途径维持TM M2表型促进UPEC诱发的睾丸炎好转。