Toll样受体的结构是典型的I型跨膜类蛋白,这类受体起到了对各种不同的疾病相关分子模式(PAMP)监视与识别的作用。通过对PAMP的识别,Toll样受体可以激活下游的免疫通路,从而引起机体的免疫应答。Toll样受体不仅在天然免疫中充当着门卫的作用,而且还将天然免疫和获得性免疫紧密地联系起来。TLR5是Toll样受体家族的一员,特点显著,其主要负责识别的PAMP为细菌的鞭毛蛋白。近年来犬类中由肠炎沙门氏菌引起的肠道疾病的数量不断攀升,人们对于犬免疫应答肠炎沙门氏菌的分子机理研究不够深入。本实验通过对TLR5基因在犬免疫应答肠炎沙门氏菌过程中分子机制的初步研究,希望可以为犬类中由肠炎沙门氏菌引起的肠道疾病的治疗提供更多选择的同时,也为犬的优良品种的选育提供理论依据。本研究的具体内容如下:1.犬TLR5基因的克隆及序列分析本研究是根据Gene Bank中已经公布的犬的TLR5基因的CDs区进行特异性引物设计的。提取犬外周血单核淋巴细胞的总的RNA,通过反转录得到cDNA,再通过聚合酶链反应扩增获得了犬的TLR5基因,并构建犬TLR5基因的克隆重组质粒PCR2.1-DogTLR5,对克隆重组质粒测序正确后应用相关的生物信息学软件分析其序列的特征。结果如下:本次克隆得到的基因序列与Gen Bank中已经公布的犬的TLR5(NC 006620.3)的基因序列比对结果显示,两者的同源性高达98%。犬TLR5的开放阅读框的大小为2577 bp,编码858个氨基酸,蛋白分子质量约94.6757 kDa,蛋白理论等电点值为8.57,蛋白不稳定系数为43.14,表明犬的TLR5为不稳定蛋白。犬的TLR5蛋白信号肽序列由其N端的前21个氨基酸构成。犬TLR5蛋白由一个胞外区,一个跨膜区和一个膜内TIR区组成,说明犬的TLR5具有I型跨膜蛋白的典型结构特征。核苷酸序列同源性比对结果显示,犬的TLR5基因与大熊猫、东北虎等哺乳动物的TLR5基因的同源性较高,分别为78.7%和76.8%。与雏鸡等禽类的同源性比较低,为52.7%2.犬TLR5基因对肠炎沙门氏菌的鞭毛蛋白的免疫应答研究在克隆的犬的TLR5基因测序正确的前提下,构建犬TLR5基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-DogTLR5。将构建成功的pcDNA3.1(+)-DogTLR5重组表达质粒与荧光素酶报告载体pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]共同转染人的HEK293T细胞。用肠炎沙门氏菌的鞭毛蛋白对共同转染后的HEK293T细胞加以刺激,检测犬的核转录因子NF-κB的活性,并通过ELISA检测细胞培养上清液中IL-8蛋白的分泌情况。结果如下:肠炎沙门氏菌的鞭毛蛋白刺激犬TLR5基因可引起NF-κB的高度活化(P<0.001),而且肠炎沙门氏菌的鞭毛蛋白刺激的细胞上清中IL-8的表达量相对于空白组有极显著差异(P<0.001)。初步验证了犬的TLR5基因能够对肠炎沙门氏菌的鞭毛蛋白产生免疫应答。3.犬PBMCs对肠炎沙门氏菌的免疫应答研究本实验用肠炎沙门氏菌体外感染犬外周血单核淋巴细胞,通过相对荧光定量PCR技术检测感染后2 h、4 h、8 h和12 h犬外周血淋巴细胞中TLR5及其下游炎性因子的mRNA相对表达量的变化情况。实验结果如下:在肠炎沙门氏菌的刺激作用下,犬的TLR5基因、IL-8基因、IL-6基因和IL-1β基因在肠炎沙门氏菌刺激后表达量都出现了上调的趋势。IL-8基因和IL-1β基因表达量与对照组的差异及显著,表明TLR5基因在抗肠炎沙门氏菌的感染过程中,可以通过激活IL-8和IL-1β这两种炎性因子的表达来介导抗细菌感染过程。