内皮祖细胞(EPC)是一类能循环、增殖并分化为血管内皮细胞,但尚未表达成熟血管内皮细胞表型特征的前体细胞。研究发现,EPC不仅参与人胚胎血管生成,同时也参与出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程。干细胞因子(SCF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF),HMG-coA还原酶抑制剂、粒系巨噬系集落刺激因子(GM-CSF)等都能白骨髓动员EPC,并促进其增殖、分化、粘附和迁移能力.氧化性低密度脂蛋白是冠心病独立危险因素,其生物学作用主要是影响内皮细胞功能,并进一步导致动脉粥样硬化。研究证明EPC对维持内皮结构和功能的完整性具有重要作用,并且参与了机体多种生理、病理性血管重建过程,在新形成的血管中,EPC来源的内皮细胞约占总内皮细胞的25%。EPC促进血管生成和内皮再生是因为EPC能够从骨髓动员到外周循环中,并归巢到血管损伤和生成的部位。EPC归巢需要多步骤协调作用,包括趋化、粘附、跨内皮迁移及最终分化为内皮细胞。最近,临床试验表明冠状动脉疾病患者培养的EPC数量及迁移能力明显下降。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)为心血管疾病的重要独立危险因素,而且冠状动脉疾病及糖尿病患者血浆oxLDL生成明显增加。以前的研究表明oxLDL能够诱导内皮细胞凋亡、增加内皮细胞粘附分子的表达、抑制内皮细胞迁移而抑制血管新生。基于以上研究背景,我们推测。oxLDL可能为影响EPC数量和功能的因素。本研究的目的是观察oxLDL是否影响外周血EPC的数量;是否改变了EPC的增殖功能、迁移功能及粘附能力;oxLDL对EPC的体外血管生成能力的影响程度;同时观察oxLDL是否影响EPC的P38信号表达,来影响EPC的数量、功能。本研究分为二个部分,主要研究方法和结果如下:第一章氧化型低密度脂蛋白对内皮祖细胞存活和功能的影响目的:研究氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,oxLDL)对EPC存活及功能的影响方法:1.EPC的分离、培养:取健康成人空腹外周静脉血,用密度梯度离心法获取单个核细胞,培养7天,收集贴壁细胞。贴壁细胞随机分成5组:①对照组;②oxLDL各浓度组(共3组):在培养液中分别加入25,50,100,200μg/ml后培养24小时;③LDL组:含100μg/ml的条件培养液培养24h。2.细胞染色与鉴定:分离获得的单个核细胞培养7d后形成了梭形的内皮样细胞。用acLDL-Dil和FITC-UEA-I对细胞染色后,通过荧光显微镜鉴定,FITC-UEA-I和Dil-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs,在荧光显微镜下(~*200)对每孔细胞进行计数3.细胞表型检测:将2×10~5贴壁细胞分别与FITC标记的VEGFR-2,CD31和CD34单克隆杭体以及PE标记的KDR,在4℃孵育30 min后,用300μl PBS悬浮细胞后上机检测。4.EPC粘附能力检测:收集贴壁细胞,悬浮在500μl培养液并计数,然后将等量EPC接种到包被有人纤维连接蛋白培养板,在37℃培养30 min,计数贴壁细胞。5.EPC迁移能力检测:收集贴壁细胞并计数。将600μl培养液和VEGF(50 ng/mL)加入改良的Boyden室的下室,将2×10~4 EPC悬浮在100μl培养液注入上室,培养24 h,刮去滤膜上面的未移动细胞,计数迁移到低层的细胞。6.EPC增殖能力检测:采用promega公司的Non-Radioactive CellProliferation Assay试剂盒MTS/PMS比色法检测细胞增殖率,按操作程序执行,简化如下:将消化的各组EPC细胞溶于含0.5%BSA的EBM-2中(含50ng/ml的VEGF)其中细胞浓度是1×10~5/ml,取各组细胞液50μl加入96孔,设三孔对照,培养72小时,各孔加入配备的染液15μl,再培养4小时,加停止液,过夜。置酶标仪于波长570nm记录各孔值,三孔对照均值作为各组本次试验值,7.体外血管生成能力检测:采用体外血管生成试剂盒检测EPC的血管生成能力.将ECM成胶。胰蛋白酶消化贴壁细胞获取EPC,并重新悬浮于培养液,调整细胞数为5×10~4/ml。将EPC接种于ECM胶上。37℃培养24h,在200倍倒置显微镜下观察小(血)管生成情况,随机选择6个显微镜视野(x200),计数小管数。结果:1.EPC的鉴定:分离获得的单个核细胞培养3天即可看到贴壁生长,7天后形成梭形的内皮样细胞。用acLDL-DiI和FITC-UEA-I对细胞染色后,通过荧光显微镜鉴定UEA-I和DiLDL双染色阳性细胞被认为是正在分化的EPC占贴壁细胞的90%。流式细胞仪检测贴壁细胞表面标志,结果显示:表达KDR(VECFR-2)(68.8±7.5)%,CD34(25.4±9.1%),CD31(71.2±7.2%)和CD144:(73.9±6.3)%,进一步明确为EPC。2.oxLDL对外周血EPC数量的影响:不同浓度的OxLDL干预EPC后24小时,结果显示:oxLDL显著减少EPC数量,并且EPC数量随着oxLDL的浓度的增加而减少。而LDL对EPC数量无影响。50μg/ml 100μg/ml,200μg/ml的oxLDL组导致EPC数量分别为46.3±4.85,34.2±3.59,22.7±2.38都较对照组EPC的70.7±7.41低,差异有显著性,P＜0.05。而oxLDL25μg/ml及LDL导致EPC数量为63.8±6.69,68.3±7.16,差异无显著性,P＞0.053.OxLDL对外周血EPC粘附能力的影响:oxLDL显著减少EPC的贴壁数,并且贴壁数随着其浓度的增加而减少,而LDL对EPC的贴壁无影响。50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml的oxLDL组导致EPC粘附数分别为21.7±2.28,16.3±1.71,10.2±1.07都较对照组EPC的30.2±3.17低,差异有显著性,P＜0.05。而oxLDL 25μg/ml及LDL导致EPC粘附数为25.8±2.71,28.3±2.97,差异无显著性,P＞0.05。4.OxLDL对外周血EPC迁移功能的影响:OxLDL各浓度组明显减少EPC的迁移能力,而LDL对EPC的迁移无影响。50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml的oxLDL组导致EPC迁移数分别为16.5±1.73,10.8±1.13,6.2±0.65都较对照组EPC的25.5±2.67低,差异有显著性,P＜0.05。而oxLDL 25μg/ml及LDL导致EPC迁移数为22.3±2.34,23.8±2.50,差异无显著性,P＞0.05。5.OxLDL对外周血EPC增殖功能的影响:EPC的增殖能力在OxLDL各浓度组抑制了EPC的增殖,并且随着其浓度的增加而加剧。LDL对EPC的增殖无影响。50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml的oxLDL组导致EPC增值率分别为0.73±0.762,0.45±0.048,0.31±0.033都较对照组EPC的1.29±0.135低,差异有显著性,P＜0.05。而oxLDL25μg/ml及LDL导致EPC增值率为1.12±0.118,1.198±0.126,差异无显著性,P＞0.05。6.OxLDL对外周血EPC体外血管生成能力的影响:体外血管生成实验模拟体内血管生成,检测EPC参与血管新生的能力.结果显示,OxLDL各浓度组显著减弱EPC的体外血管生成能力,在浓度为200μg/ml时最为显著。而LDL对EPC的成血管能力无影响。50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml的oxLDL组导致EPC成血管数数分别为19.2±2.01,13.2±1.38,9.5±1.00都较对照组EPC的26.2±2.75低,差异有显著性,P＜0.05。而oxLDL 25μg/ml及LDL导致EPC迁移数为23.0±2.41,25.8±2.70,差异无显著性,P＞0.05。结论:1.OxLDL在体外能减少EPC数量,作用呈浓度依赖性;2.OxLDL在体外能抑制EPC的增殖、迁移、粘附能力,作用呈浓度和依赖性;3.OxLDL能降低EPC的体外血管生成能力:提示OxLDL是导致EPC数量及功能减弱的因素之一。第二章P38信号通路参与oxLDL对内皮祖细胞数量和功能的影响目的:研究oxLDL是否导致EPC细胞内P38及P-P38的表达异常,以及oxLDL对EPC的作用是否与细胞内P38的信号有关。方法:1.EPC分离,培养,及分组:EPC的分离及培养见第一章,收集贴壁细胞。贴壁细胞随机三组:①对照组:②oxLDL组:在培养液中加入100μg/ml的oxLDL③SB203580组:在培养液中加入100μg/ml的oxLDL前,预先半小时加入0.5μM的SB203580。2.Western检测p38及p-p38的表达:oxLDL(100μg/ml)处理EPC后0,5,15,25,35分钟及SB203580预处理后细胞内p38,及p-p38蛋白的表达;以及oxLDL 25,50,100,200μg/ml以及LDL100μg/ml处理30分钟后细胞内p38,及p-p38蛋白的表达。3.EPC凋亡分析:按BD Biosciences公司的说明进行操作:各组EPC处理结束后,用0.1%胰酶消化,4°C PBS洗两次后,重悬于结合缓冲液中,调整细胞浓度为1 X 106/ml。取100μl细胞悬液至5 ml试管中,加5μlAnnexin V-FITC标记液和5μl PI,轻轻混匀。并设立无Annexin V及PI的空白对照、仅Annexin V的对照、仅PI的对照。室温避光孵育15min后,加400μl结合缓冲液,1小时内上流式细胞仪检测EPC双染色鉴定EPC数量,EPC粘附能力检测,迁移能力检测,EPC增殖能力检测,体外血管生成能力检测实验方法见第一章结果:1.western检测结果:100μg/ml的oxLDL处理EPC后,细胞内p-p38成时间依赖性表达增强,大约25min时达顶峰,5,15,25,25,35分钟细胞内p-p38的表达是对照组的1.4±0.15倍,2.1±0.22倍,3.2±0.34倍,1.5±0.13倍,且p38拮抗剂sb203580可抑制其表达,是对照组的1.2±0.13倍,与各时间点比较有显著性差异,P＜0.05。不同浓度的OxLDL处理25min后观察,细胞内p-p38成剂量依赖性表达增强,25μg/ml,50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml处理EPC后,其细胞内p-p38的表达是分别对照组的1.2±0.13,1.7±0.18,3.2±0.35,3.4±0.35。而LDL对其没影响。细胞内p38表达不受时间和浓度的影响。2.100μg/ml的oxLDL处理EPC后,导致EPC数量减少,增殖减低,凋亡增加,粘附及迁移能力减低,体外成血管能力减弱。而sb203580能减弱100μg/ml的oxLDL对EPC的作用。其中对照组,oxLDL组和SB+oxLDL组的EPC数量分别为71.8±7.52,32.5±3.40,52.8±5.85;粘附细胞数分别为31.7±3.32,16.3±1.71,24.5±2.57;迁移细胞数分别为24.2±2.53,10.5±1.10,18.2±1.91;体外成血管细胞数分别为25.2±2.64,12.3±1.29,17.8±1.87。各组增殖率分别为1.32±0.139,0.45±0.048,1.133±0.119。各组的凋亡率分别10.2±1.07%,21.3±2.23%,13.2±1.4%。SB+oxLDL与oxLDL组比较,在细胞数量,增殖,凋亡及黏附,迁移,体外成血管能力方面有差异显著性,P＜0.05。结论:oxLDL对EPC的作用与细胞内磷酸化的p38表达及活性有关。P38的抑制剂sb203580能抑制oxLDL对EPC的毒性作用。提示oxLDL对EPC的作用是通过细胞p38信号作用的。