论文部分内容阅读
目的： 为了增加可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ与TNFα的亲和力，对人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部（sTNFRⅡ-gAD）融合蛋白进行改构，构建了融合基因人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部-Fc（sTNFRⅡ-gAD-Fc）的真核表达载体，利用富含“GC”的方法代替DHFR扩增体系，在CHO-S细胞中实现了sTNFRⅡ-gAD-Fc快速高效表达，探索了无血清悬浮流加培养方法，为进一步优化一套高密度、高效表达该融合蛋白的大规模悬浮流加培养工艺打下良好基础。 方法： 1.构建pAAV2-sTNFRⅡ-gAD-Fc和pMH3-sTNFRⅡ-gAD-Fc表达质粒 通过PCR和重组PCR的方法，将人IgG1 Fc和sTNFRⅡ-gAD基因片段重组，得到融合基因sTNFRⅡ-gAD-Fc。分别克隆至不同的真核表达载体pAAV2neo-CMV-MCS-PGK-DHFR和pMH3中，构建pAAV2-sTNFRⅡ-gAD-Fc和pMH3-sTNFRⅡ-gAD-Fc重组质粒。 2.建立表达sTNFRⅡ-gAD-Fc的CHO/dhfr-和CHO-S细胞株 脂质体法将pAAV2-sTNFRⅡ-gAD-Fc转染至CHO/dhfr-细胞中，电转染法将pMH3-sTNFRⅡ-gAD-Fc导入CHO-S细胞中，G418筛选2周，得到稳定表达的多克隆细胞株，单克隆化，斑点杂交和Western blot分析sTNFRⅡ-gAD-Fc的表达。斑点杂交比较sTNFRⅡ-gAD-Fc在CHO/dhfr-和CHO-S细胞中的表达，选择快速高效的富含GC的CHO-S表达体系进行蛋白的大量制备，3轮单克隆挑选，筛出稳定高表达的CHO-S/pMH3-sTNFRⅡ-gAD-Fc细胞株。 3.在CHO-S细胞中制备sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白 3.1贴壁培养 将筛选的高表达单克隆在T75方瓶中贴壁培养，随后分别换成不含FBS的DMEM/F12和无血清培养基B001培养以收集上清。 3.2悬浮培养 ①摇瓶中悬浮批次培养 将高表达单克隆用无血清培养基B001悬浮驯化培养，得到适合悬浮生长的稳定高表达工程细胞株。 在摇瓶中依次进行了60mL、120mL悬浮批次培养，即2.0×106cells/mL的接种密度，120rpm，37℃恒温振荡持续培养。 ②转瓶及生物反应器中流加培养 悬浮培养规模从摇瓶扩大到转瓶，最终扩到生物反应器，在转瓶和反应器中分别进行了200mL、3L的流加培养，即:初始接种密度2.0×106cells/mL，当达到4.0×106cells/mL以上时开始流加培养，以每日葡萄糖残余量2g/L左右作为流加体积的控制参数。 4.sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白的纯化 培养上清经ProteinA琼脂糖亲和法分离纯化，收集洗脱峰，SDS-PAGE和Westemblot分析。 5.sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白活性检测 MTT法检测sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白中和TNFα杀伤L929细胞的活性。比较sTNFRⅡ-gAD-Fc、sTNFRⅡ-gAD和sTNFRⅡ-Fc拮抗TNFα的能力的差异。 结果： 1.成功构建pAAV2-sTNFRⅡ-gAD-Fc和pMH3-sTNFRⅡ-gAD-Fc表达质粒 构建的pAAV2-sTNFRⅡ-gAD-Fc和pMH3-sTNFRⅡ-gAD-Fc重组质粒经双酶切鉴定正确，DNA测序，在IgG1 Fe片段上存在2个突变位点，即其第90位和186位的GTC(缬氨酸)分别突变为ATC(异亮氨酸)和GAC(天冬氨酸)，但后期实验表明这两处的点突变并不影响蛋白的结构与生物活性。 2.成功建立稳定高表达sTNFRⅡ-gAD-Fc的CHO/dhfr-和CHO-S细胞株 转染的细胞经过G418筛选及单克隆化，dot blot分析，sTNFRⅡ-gAD-Fc在CHO/dhfr-细胞中基础表达量较低（10μg/mL左右），需要较长的MTX加压提高表达量。而在CHO-S细胞中，仅经过一次单克隆挑选即可获得75μg/mL的高表达单克隆。因而，选择在CHO-S细胞中表达该蛋白，经过3次单克隆挑选，得到较纯表达量高的单克隆以备后期大量培养。 Western blot分析，还原的sTNFRⅡ-gAD-Fc样品，在大约75kDa处出现特异性条带，非还原的样品，仅分别在大约170kDa处和远大于250kDa处出现特异性条带，提示sTNFRⅡ-gAD-Fc以二聚体和多聚体形式表达，无单体蛋白。 3.sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白的生产 在T75方瓶中分别用不含FBS的DMEM/F12和B001培养基培养6-7天，蛋白纯化后产量分别大约为5.0mg/L和7.5mg/L。 摇瓶中60mL、120mL批次培养7天，蛋白产量为10.0mg/L和9.2mg/L，转瓶中200mL及反应器中3L流加培养7-8天，蛋白产量为18.3mg/L和20.5mg/L。 4.sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白纯化 洗脱的蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析，证实是sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白，纯度约95％。 5.sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白的活性 sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白具有显著抑制TNFα杀伤L929细胞的活性，且呈剂量依赖性。得到sTNFRⅡ-gAD-Fc，sTNFRⅡ-gAD和sTNFRⅡ-Fc的ECs0分别为0.4904，0.3201和1.075，比活分别是0.20×107u，0.31×107u，0.093×107 u。 结论： 本实验成功构建了sTNFRⅡ-gAD-Fc的真核表达载体，在CHO/dhfr-细胞和CHO-S细胞中实现表达。但在转染的CHO-S细胞中可快速筛选出高表达（75g/mL）单克隆细胞株，sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白以二聚体和多聚体形式分泌表达，该蛋白具有显著抑制TNFα杀伤L929细胞的活性。最终利用CHO-S细胞系统实现了sTNFRⅡ-gAD-Fc融合蛋白悬浮批次培养和流加培养中高效表达，为建立一套高密度、高效表达该融合蛋白的悬浮流加培养中试工艺打下了良好基础。