世界卫生组织已将糖尿病列为三大非传染性疾病之一,患病率逐年升高。糖尿病属于慢性疾病,中晚期伴随着各种并发症,威胁生命健康,降低生活质量。因此,对糖尿病进行干预,加强对糖尿病发病机制的研究,开发新型有效的药物具有重要作用。中药治疗糖尿病的历史悠久,我国第一本医书《黄帝内经素问》中就已经记录了“消渴病”的病名。葛根是豆科植物,主消渴,味甘平,有生津止渴的作用,葛根素(puerarin)为葛根的主要有效成分,属于异黄酮类化合物,现代药理学研究表明葛根素治疗糖尿病的疗效确切,但其作用机制尚不明确。本课题研究以葛根素为模型药物,拟从分子、细胞及整体动物水平,探讨葛根素的降糖作用机制。主要内容:1.葛根素对三种糖尿病模型小鼠的降糖作用研究此试验中我们共选用三种糖尿病模型小鼠,分别为STZ(streptozotocin,链脲佐菌素)诱导的糖尿病小鼠、HFD(high fat diet)诱导的糖尿病小鼠和自发糖尿病的db/db小鼠模型。(1)葛根素对三种糖尿病模型小鼠生化指标的影响:葛根素可以明显降低三种糖尿病模型小鼠的血糖水平,改善其糖耐量,提高血浆胰岛素水平。葛根素能够降低HFD诱导的糖尿病小鼠和自发糖尿病的db/db小鼠的CHO(cholesterol,胆固醇)和TG(triglyceride,甘油三酯)水平,具有降血脂功效。对于HFD诱导的糖尿病小鼠,葛根素可以抑制瘦素(leptin)表达(P<0.01);而在自发糖尿病模型db/db小鼠中,葛根素可以增加脂联素(adiponectin)表达(P<0.05)。(2)葛根素对三种糖尿病模型小鼠肝脏中AMPK和AKT通路的作用:通过对小鼠肝脏中有关蛋白表达量进行分析,证明了葛根素可以增强肝脏中p-AKT,p-GSK-3β和p-AMPK活性,激活AKT通路和AMPK,调节肝脏内的糖代谢,增加葡萄糖的吸收,减少糖异生,促进糖原合成,使小鼠肝脏受损的代谢功能得以修复,恢复肝脏调节糖代谢和能量代谢的功能,从而缓解糖尿病的症状。(3)葛根素对三种糖尿病模型小鼠肝脏中G6pase mRNA表达量的影响:对于三种糖尿病模型小鼠,葛根素下调了 G6pasemRNA表达量,从而抑制肝脏中糖异生过程,达到降低血糖的目的。(4)葛根素对三种糖尿病模型小鼠胰腺中胰岛β细胞的影响:对于STZ诱导的糖尿病小鼠,葛根素能够修复STZ破坏的胰岛结构,使胰岛比较饱满,边界清晰。对于HFD诱导的糖尿病小鼠和自发糖尿病的db/db小鼠,葛根素均能逆转胰岛萎缩,并且免疫荧光染色发现了 β细胞中Ki67蛋白的表达,表明胰岛β细胞存在分裂增殖,提示葛根素对其有促进增殖的作用。2.葛根素对胰岛β细胞胰岛素分泌功能的作用选用MIN6细胞作为研究对象,用高浓度的葡萄糖或炎症因子体外模拟糖尿病环境,检测MIN6细胞胰岛素分泌功能。结果表明,MIN6细胞在高浓度的葡萄糖或炎症因子环境下,刺激指数比值明显降低,葛根素能够改善这一情况,将刺激指数比值恢复到接近正常水平。3.葛根素对胰岛β细胞增殖及凋亡的影响及作用机制进一步考察葛根素对胰岛β细胞生存的作用,我们从小鼠体内分离原代胰岛细胞进行培养,在高浓度的葡萄糖或炎症因子处理后,通过Ki67及TUNEL染色,发现葛根素给药组Ki67蛋白的表达增加,并且TUNEL检测结果证实葛根素具有减少胰岛β细胞凋亡的作用。INS-1细胞在高浓度的葡萄糖或炎症因子环境培养后,western blotting实验检测结果观察到,葛根素可以上调PDX-1,p-AKT,p-GSK-3β 和 TCF7L2 表达,而下调 cleaved Caspase-3 的表达,提示其促进胰岛β细胞增殖的机制与AKT通路和Wnt通路有关。结论:通过分子,细胞及整体动物三个层次的实验研究,证实葛根素能够降低糖尿病模型小鼠血糖和血脂,其作用机制通过AKT通路和Wnt通路激活,实现增强胰岛β细胞的分泌功能,促进胰岛β细胞分裂增殖,减少β细胞凋亡,进而改善机体的糖脂代谢功能。