善宁对大鼠重症急性胰腺炎胰腺细胞凋亡作用机制及对外周血中性粒细胞细胞凋亡的影响

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目的:本实验研究生长抑素类似物(善宁(?) Sandostatin)对重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)大鼠外周血中性粒细胞凋亡的影响;并研究生长抑素类似物(善宁(?)Sandostatin)对SAP时大鼠胰腺细胞凋亡及凋亡相关基因bax、bcl-2的影响。方法:雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠48只,称重,编号。随机分为4组:(重症胰腺炎组)SAP组、(善宁治疗组)SDT组、(乌司他丁治疗组)UTI组、(假手术组)SO组。每组按时间又分为4小时和14小时两个亚组,每个亚组6只。成功制模后,第一亚组于4小时后处死,另一亚组于14小时后处死。处死大鼠后,自大鼠心脏抽血6ml,其中3ml留作检测中性粒细胞凋亡,余下3ml经处理后送生化室检测血清淀粉酶。取病灶处新鲜胰腺组织置于4%多聚甲醛溶液中固定。提纯中性粒细胞送流式细胞仪检测中性粒细胞凋亡;应用全自动生化仪检测血清淀粉酶含量;部分胰腺组织常规HE染色;部分胰腺组织按操作要求行免疫组化染色,检测bax、bcl-2基因蛋白表达;部分胰腺组织TUNEL染色,光镜下计算凋亡指数。结果:(1)各组AMY比较:SDT4组、UTI4组、SO4组的AMY水平较SAP4组的AMY水平明显偏低,差异有统计学意义(P<0.05),SDT14组、UTI14组、SO14组的AMY水平较SAP14组的AMY水平明显偏低,差异有统计学意义(P<0.05)。而SO4组的AMY水平较SDT4组、UTI4组AMY水平显著偏低,差异有统计学意义(P<0.05),SO14组的AMY水平较SDT14组、UTI14组的AMY水平明显偏低,差异有统计学意义(P<0.05)。而其余各组之间及各亚组之间的AMY水平无明显差别。(2)大体标本及HE染色:切取胰腺时在肉眼下可见SAP组、SDT组、UTI组腹腔内均有大量血性腹水,胰腺充血肿胀明显,与周围组织粘连紧密,甚至少量发黑坏死。SO组仅可见肠系膜轻微水肿。SAP组、SDT组、UTI组HE染色均可见炎症细胞浸润,腺细胞肿胀,灶状、大量纤维素样坏死、结构紊乱,可见典型的细胞凋亡形态学变化。SO组无明显异常发现。(3)胰腺组织bax基因蛋白表达:免疫组化SABC法结果显示bax蛋白表达在胰腺腺泡细胞胞浆,SO4组基因bax蛋白表达弱(1.93±1.2), SDT4组(14.16±2.54)、UTI4组(11.07±2.57)与SAP4组(11.25±2.33)表达明显增强,差异有统计学意义(P<0.05);SDT14组、UTI14组与SAP14组基因bax蛋白表达较SO14组基因bax蛋白表达明显增强,差异有统计学意义(P<0.05)。SDT组4、14小时基因bax蛋白表达均高于UTI组与SAP组、SO组4、14小时亚组,统计学处理各组之间差异有显著性(P<0.05)。其余各组之间,各组4小时亚组与14小时亚组之间无明显统计学意义。(4) bcl-2基因蛋白表达:bcl-2蛋白表达在胰腺导管细胞, SO4组bcl-2基因蛋白表达弱(2.82±1.80), SDT4组(17.69±2.27)、UTI4组(17.23±3.65)与SAP4组(13.84±2.38)表达明显增强,差异有统计学意义(P<0.05),SDT14组、UTI14组与SAP14组基因bcl-2蛋白表达较SO14组基因bcl-2蛋白表达明显增强,差异有统计学意义(P<0.05)。UTI组中各4、14小时亚组bcl-2蛋白表达高于SAP组差异有统计学意义(P<0.05),但与SDT组之间无明显统计学意义;SDT组中各4、14小时亚组bcl-2蛋白表达明显高于SAP组(P<0.05)。各4、14小时亚组之间无明显统计学意义。(5)胰腺细胞的凋亡指数:TUNEL结果表明SDT4组胰腺细胞凋亡指数为(6.03±0.93),明显高于SAP4组(4.73±1.07)、SO4组(1.69±1.39)、UTI4组(4.68±1.06),差异有统计学意义(P<0.05)。而UTI4组虽胰腺细胞凋亡指数明显高于SAP4组,但无明显统计学意义。SO4组胰腺细胞凋亡指数明显低于其他各组(P<0.05)。SDT14组胰腺细胞凋亡指数明显高于SAP14组、SO14组与UTI14组,差异有统计学意义(P<0.05)。而UTI14组虽胰腺细胞凋亡指数明显高于SAP14组,但无明显统计学意义。SO14组胰腺细胞凋亡指数明显低于其他各组(P<0.05)。SAP组4小时亚组的凋亡指数(4.73±1.07)明显高于14小时亚组(2.81±0.93) (P<0.05),其他组也呈现这种变化,但无明显统计学意义。(6)中性粒细胞凋亡的检测:4小时SDT组中性粒细胞凋亡率(5.53±2.19)较SO组(1.50±0.76)、SAP组(2.85±1.27)明显增高,差异有统计学意义(P<0.05),与UTI (7.06±1.86)组无统计学意义;14小时SDT组(3.59±1.04)中性粒细胞凋亡率与SO组(1.32±0.53)、SAP组(1.90±0.89)明显增高,差异有统计学意义(P<0.05),低于UTI组(5.22±1.58),差异有统计学意义(P<0.05)。4小时UTI组中性粒细胞凋亡率较SO组、SAP组明显增高,差异有统计学意义(P<0.05);14小时UTI组中性粒细胞凋亡率较SO组、SAP组、SDT组均明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。SDT组、UTI组4小时亚组中性粒细胞凋亡率均较14小时亚组明显较高,差异有统计学意义(P<0.05),SAP组与SO组4小时与14小时亚组之间无统计学意义。结论: 1.在SAP过程中早期应用善宁仍可以起到诱导胰腺细胞凋亡的作用,减轻胰腺细胞坏死。乌司他丁抑制胰酶的作用并不能明显促进胰腺细胞的凋亡。bax基因蛋白主要表达在胰腺腺泡细胞胞浆中,善宁可以调高其表达。bcl-2基因蛋白主要表达于胰腺导管细胞中,善宁和乌司他丁均能够调高bcl-2基因的表达。2.善宁和乌司他丁均有改善SAP时中性粒细胞凋亡滞后的作用,但随着时间的延长,乌司他丁在促使中性粒细胞凋亡的效果较善宁更明显。
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